酚類物質添加對‘黑比諾’干紅葡萄酒發酵階段主要香氣成分的影響

楊 博，張 波，王學慶，吳娟弟，韓麗婷，李寧寧，韓舜愈

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅省葡萄與葡萄酒產業技術研發中心，蘭州 730070)

香氣是評價葡萄酒品質的重要指標之一，其種類和含量構成不同葡萄酒的風格特征[1-2]。研究表明，葡萄酒中己有1 300多種香氣化合物被報道，并受葡萄果實自身、葡萄酒釀造過程和陳釀條件的影響[1-3]。同時，部分研究也指出，葡萄酒的香氣除與上述因素直接相關外，酒中的一些基質成分也會對香氣的表達產生作用，在一定程度上影響葡萄酒的香氣質量[4-5]。因此，研究酒中基質成分對其香氣物質的影響，對控制和提高葡萄酒的香氣品質具有重要意義。

多酚作為葡萄酒中一類重要的基質成分，除在葡萄酒的口感和色澤上有較大貢獻外，對改變體系香氣組分濃度和質量也有影響[6-7]。例如，在含多酚的模擬溶液中，4-乙基苯酚和4-乙基愈創木酚的揮發程度隨多酚含量的增加而顯著降低，尤其當達到最高濃度時，其含量較對照分別減少了24.2%和26.4%[4]。同時，多酚與香氣物質的作用具有一定的選擇性，例如相比于較難結合的檸檬烯分子，兒茶素即便在較低濃度下也會對乙酸異戊酯、己酸乙酯和苯甲醛產生強烈的親和力[8]。多酚還會影響香氣化合物的氣味感知和風味質量。Lund等[9]發現，增加溶液中兒茶素和槲皮素的濃度會明顯降低3-巰基己醇的嗅感強度。而含多酚溶液在對β-苯乙醇等受試香氣物質風味特征減弱的同時，其嗅感強度還存在隨多酚濃度變化的特點[10]。

咖啡酸是葡萄酒中主要的酚類化合物，而迷迭香酸是咖啡酸的結構類似物(由咖啡酸和丹參素酯化形成)，兩者在自然界中均屬常見的多酚物質[11]。有研究分別測試了咖啡酸和迷迭香酸等酚類物質的輔色特性，發現其對葡萄酒的色澤具有較好的保護作用[12-13]。不過筆者在前期研究中除發現上述酚酸產生的輔色效應外，還觀察到其對葡萄酒香氣也產生作用，并且結構相似的多酚存在不同的作用效果[11]。

盡管在葡萄酒的生產中添加酚類物質已成為常見的操作，但在以往研究中較多的報道主要集中在其對葡萄酒色澤品質方面，而對其他品質的影響卻少有報道，尤其是多酚對葡萄酒呈香方面，大量的研究結果或來自于模擬試驗，或是對樣品的靜態測定，對于在發酵過程添加酚類物質引起香氣成分動態變化的報道目前還相對有限。因此，本試驗擬以甘肅河西走廊產區‘黑比諾’葡萄為試材，通過在酒精發酵前添加具有良好輔色性能的咖啡酸與迷迭香酸等酚類物質，探究其對發酵階段葡萄酒中主要香氣成分的影響，以期為進一步開展酚類物質在葡萄酒生產中的應用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：黑比諾葡萄(Pinot Noir)，甘肅景泰釀酒葡萄種植基地，可溶性固形物21.7°Brix、可滴定酸6.50 g/L(酒石酸計)、pH為3.61；釀酒酵母(D254)、乳酸菌(Oenococcusoeni)，法國Laffort公司；果膠酶，法國Lallemand公司。

試劑：咖啡酸、迷迭香酸(食品級)，陜西潤生生物科技有限公司；2-辛醇(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；乙醛、偏重亞硫酸鉀、沒食子酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、碘、碘化鉀、淀粉(分析純)，上海源葉生物科技有限公司；乙酸鈉、乙酸、鹽酸、氯化鉀、氯化鈉(分析純)，天津市光復科技發展有限公司。斐林試劑、次甲基藍指示劑等按照GB/T 603-2002進行配制。

1.2 儀器與設備

pH計(PHS-3C)，上海雷磁儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；TD5A-WS臺式低速離心機，東莞康潤試驗科技有限公司；固相微萃取裝置、 50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅萃取頭，美國Surpelco公司；TRACE1310-ISQ氣相色譜-質譜聯用儀，法國Salleron公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 釀造工藝 葡萄原料→分選→除梗破碎后均勻分裝在9個20 L的不銹鋼桶中(添加60 mg/L SO2，20 mg/L果膠酶)→進行未加酚酸、分別添加150 mg/L咖啡酸和迷迭香酸3種處理(試驗前參考已有文獻報道[14])→4 ℃恒溫冷浸漬48 h→室溫下回溫至16 ℃→酒精發酵(添加200 mg/L釀酒酵母)→皮渣分離→蘋-乳發酵(添加20 mg/L商業乳酸菌)→發酵結束。

根據發酵工藝，按比重分別在葡萄破碎(Init)、酒精發酵前(PFM)、酒精發酵中期(m-FA)、酒精發酵結束(e-FA)、蘋-乳發酵中期(m-MLF)、蘋-乳發酵結束(e-MLF)6個點取樣，每個取樣點取樣量為200 mL，分裝于棕色瓶中，迅速置于 -20 ℃冰箱保存，待測。每個處理重復3次。

1.3.2 葡萄酒基本理化指標測定 酒精度、殘糖(葡萄糖計)、總酸(酒石酸計)、揮發酸(乙酸計)、pH、游離和總SO2參照GB/T 15038-2006[15]測定。

1.3.3 葡萄酒香氣化合物測定 香氣物質萃取和GC-MS檢測條件參照魯榕榕等[16]的方法。

定性分析：采用質譜信息、NIST08標準譜庫對比，以及參考相關文獻相結合的方法進行定性分析。

定量分析：采用內標法進行半定量分析，內標為2-辛醇。計算公式如下：

各香氣成分含量=(各組分的峰面積×內標物質量濃度)/內標物峰面積

1.3.4 香氣輪廓分析 參考Capone等[17]的方法，并根據葡萄酒香氣輪中的香氣類型[1]將試驗香氣物質分為果香、花香、植物味、化學味、脂肪味、香料味等。樣品中檢測到的主要揮發性物質按其氣味特征進行分組，氣味特征類似的物質歸為同類，并計算該類的氣味活性值(Odor Activity Value，OAV)總和，即可對香氣輪廓進行模擬。

OAV值=香氣化合物含量/閾值

1.3.5 數據處理與分析 利用Microsoft Office Excel 2010和Origin 2018對試驗所得數據進行處理及作圖，使用IBM SPSS Statistics 20進行顯著性分析(Duncan’s法，P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 酒樣理化指標

由表1可知，3組處理酒樣總糖<4.00 g/L，酒精度>11.00%，表明供試樣品符合國標GB/T 15037-2006干型葡萄酒的要求。樣品的揮發 酸<1.20 g/L，說明生產過程衛生條件控制良好，且酒樣的總酸、pH、SO2等指標也均滿足國標規定。

表1 酒樣的基本理化指標Table 1 Basic physical and chemical indexes of wine samples

2.2 添加處理對黑比諾干紅葡萄酒香氣品質的影響

采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用方法對供試樣品的揮發性成分進行測定，共檢出酯類、醇類、酸類、萜烯類和其他類等5類組分，共計125種香氣化合物。基于已報道的文獻資料[18-21]，并綜合考慮各揮發性物質含量、閾值水平和OAV值等因素，最終篩選出共同含有且含量較高的26種香氣物質進行具體分析。

2.2.1 發酵過程中酒樣主要香氣物質分析 共檢測到酯類物質54種，其中乙酸乙酯、丁酸乙酯和辛酸乙酯等8種為主要化合物。由圖1可知，隨著發酵時間的延長，酒樣中大多數的酯類物質在蘋-乳發酵階段(MLF)含量積累達到峰值。例如己酸乙酯，咖啡酸處理酒樣在PFM時含量最高，隨后其含量逐漸增加，在m-MLF達到峰值，較PFM時提高575.52～2 685.26 μg/L。e-MLF后，咖啡酸處理酒樣中己酸乙酯含量達到 1 498.35 μg/L，分別是對照和迷迭香酸處理的 1.11倍和4.57倍。類似的現象在乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯的變化

中也有體現。同時，試驗結果顯示，迷迭香酸的添加對發酵階段酯類含量的積累有明顯抑制效果(P<0.05)。隨著發酵過程的進行，迷迭香酸處理的酒樣中以上各酯類濃度均明顯低于咖啡酸和對照樣品。例如，辛酸乙酯從PFM到酒精發酵結束(e-FA)，盡管各酒樣均具有升高的變化趨勢，但其含量卻表現為對照>咖啡酸>迷迭香酸的序列效果。而在MLF階段，辛酸乙酯濃度逐漸降低，但依舊表現出迷迭香酸處理下含量較低的現象(P<0.05)。對于丁酸乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯而言，雖有個別時期添加酚酸處理樣品有較高的含量，但總體也表現出酚類處理后濃度下降的變化，并且迷迭香酸處理效果高于咖啡酸處理組和對照組。甚至對于乙酸異戊酯，筆者還觀察到迷迭香酸處理后其含量積累峰值推遲的變化。研究表明，乙酸酯類物質主要是由微生物的代謝產生。因此筆者推測試驗觀察到的乙酸酯類濃度降低的情況可能與添加酚類物質減緩微生物代謝效率有關[20]。此外，從圖1還可看到，伴隨著MLF的進行，乳酸異戊酯的含量也發生了類似的變化。這可能是MLF過程中產生的乳酸與酒中的高級醇酯化的結果。不過相比于對照，咖啡酸處理酒樣中乳酸異戊酯含量相對較高(P<0.05)，而迷迭香酸處理酒樣中的乳酸異戊酯含量卻降低44.21%(e-MLF)。

從樣品中檢測到6種主要醇類化合物(圖2)，其中正己醇、2,3-丁二醇和苯乙醇等在MLF階段含量最高，隨后其濃度均逐漸降低，而丙醇、異戊醇和苯甲醇等3種醇類物質伴隨發酵的進行含量逐漸增加，并在e-AF達到峰值。同時，丙醇在PFM到e-FA期間的含量表現出咖啡酸>迷迭香酸>對照的現象。而與丙醇表現不同的是，正己醇在迷迭香酸處理樣品中的含量顯著增加，并在m-MLF時含量達到最高，較對照和咖啡酸分別高出17.76%和60.84%，這將對增加酒體的甜香感有積極意義。類似的現象在2,3-丁二醇的變化中也有發現。此外，咖啡酸處理酒樣中苯乙醇在PFM到e-MLF整個發酵過程中含量較高，而迷迭香酸處理酒樣濃度卻顯著低于對照 (P<0.05)。研究認為，苯乙醇可能來自發酵過程中苯丙酮酸的代謝，并通過莽草酸途徑形成分支酸，之后在變位酶的催化下，經脫水、脫羧作用形成[22]。而咖啡酸為莽草酸代謝過程中的一種中間產物，因此推測外源添加的咖啡酸可能作為苯乙醇合成的底物參與了其形成的積累過程。

從3種供試樣品中檢測到13種酸類物質，其中異丁酸、正己酸、正辛酸和正癸酸4種是主要的酸類化合物。由圖3可知，大多數酸類化合物在整個發酵過程的變化趨勢與酯類物質相似。異丁酸在m-FA到m-MLF過程中其含量逐漸增加，表現為對照>咖啡酸>迷迭香酸的效果，并在m-MLF時含量積累達到最高，隨后在MLF階段含量逐漸降低，且咖啡酸處理明顯表現出濃度增加的現象(e-MLF階段，咖啡酸處理較對照和迷迭香酸分別增加了26.07%和25.10%)。而正癸酸在PFM至e-MLF階段，其咖啡酸處理酒樣的含量顯著高于對照和迷迭香酸處理酒樣 (P<0.05)，例如在e-MLF階段，其濃度分別是對照和迷迭香酸處理酒樣的2.67倍和5.13倍。試驗檢測到的正辛酸也具有類似的現象。同時，試驗還發現，添加咖啡酸和迷迭香酸處理的葡萄酒中正己酸含量表現出明顯的差異(P<0.05)，如在m-FA時，咖啡酸處理酒樣的含量最高為25.57 μg/L，分別高出對照和迷迭香酸處理酒樣的 50.32%和72.30%。研究表明，葡萄酒中的酸類化合物濃度較低時可增加果酒香氣的復雜性，含量過高則會產生令人不快的感覺[23-24]。就整個發酵過程而言，迷迭香酸處理酒樣中正己酸含量的峰值出現推遲的現象，并在MLF過程中降低至消失，這將會減弱對樣品帶來的負面影響，推測這可能與發酵過程中香氣物質的揮發損失、代謝分解或合成其他物質有關。此外，本試驗中有少量揮發性脂肪酸類物質生成，同對照相比，隨發酵過程的進行，其在迷迭香酸處理酒樣中濃度相對較低，且濃度遠低于閾值，這將有助于改善葡萄酒的風味，對葡萄酒具有積極的貢獻。

本試驗檢測出香茅醇、香葉醇和α-松油醇等3種主要的萜烯類化合物。分析圖4各香氣物質的變化可知，隨著發酵時間的延長，供試酒樣中香茅醇、香葉醇的含量逐漸增加，并在酒精發酵階段達到峰值，例如兩個處理樣品中的香茅醇在整個發酵階段的濃度均低于對照(m-MLF時期除外)，特別在e-FA時，咖啡酸和迷迭香酸處理較對照酒樣分別降低58.75%和91.68%，表現出迷迭香酸對其具有顯著的抑制效果(P<0.05)。類似的變化在香葉醇中也有體現。咖啡酸處理酒樣中α-松油醇在m-MLF至e-MLF時含量顯著高于其余兩組樣品(P<0.05)，并在m-MLF階段含量積累達到峰值。另外，對照、咖啡酸和迷迭香酸處理酒樣中的α-松油醇從破碎時(Init)的 0.16 μg/L分別增加到1.62 μg/L、2.93 μg/L和 2.16 μg/L，特別是在e-MLF時期，咖啡酸處理酒樣中α-松油醇是對照的2.97倍，而迷迭香酸處理酒樣較對照組增加17.95%。同時，試驗還檢測到β-大馬士酮等C13-降異戊二烯類化合物。由圖4可知，β-大馬士酮在m-MLF至e-MLF發酵過程中含量表現為咖啡酸>對照>迷迭香酸的變化趨勢，在m-MLF階段，咖啡酸處理酒樣達到峰值，較對照和迷迭香酸處理分別增加 16.31%和 50.97%。而迷迭香酸處理和對照組在e-FA時其含量最高，之后各酒樣的含量均有所降低。在e-MLF時咖啡酸處理酒樣的β-大馬士酮濃度高出其余兩個處理酒樣的4.52%～ 20.82%，這將有可能增強酒體的花果香。

此外，本試驗還檢測出12種其他類物質，其中壬醛、苯甲醛、2,4-二叔丁基苯酚、2,6-二叔丁基對甲酚等4種是主要的香氣化合物，這些物質對于酒體的平衡有一定的貢獻。由圖5可知，苯甲醛、2,4-二叔丁基苯酚、2,6-二叔丁基對甲酚在e-FA和m-MLF時期含量達到最高，隨后各物質濃度逐漸下降。本試驗還發現咖啡酸處理酒樣中2,4-二叔丁基苯酚含量峰值推遲的現象，且相應含量在m-MLF至e-MLF階段表現為咖啡酸>迷迭香酸>對照的效果。迷迭香酸處理酒樣中的2,6-二叔丁基對甲酚在m-MLF時的濃度出現極值，分別高出對照和咖啡酸處理樣品的10.27%和20.39%，而壬醛在整個發酵過程中卻表現出與上述物質不同的變化規律，在供試酒樣中其含量均呈上升趨勢。同Init時期相比，對照、咖啡酸和迷迭香酸處理酒樣中的壬醛在e-MLF時分別提高10.81 μg/L、10.70 μg/L和9.83 μg/L，且添加酚類物質的酒樣表現出明顯的抑制效果 (P<0.05)。

2.2.2 酒樣香氣輪廓模擬、主成分及聚類熱圖分析 供試葡萄酒中的香氣成分主要包括酯類、醇類、酸類、萜烯類和其他類等125種香氣化合物，這些香氣化合物可通過累積、協同、抑制和掩蔽等作用使葡萄酒的香氣復雜多變[17]。因此，為了直觀體現葡萄酒的香氣特征，以e-MLF的酒樣為基準，參考已報道的文獻資料[18-21]，并綜合考慮各揮發性物質的含量及閾值水平等因素，筆者對供試酒樣中檢出的125種揮發性化合物進行篩選， 共挑選出50種特征香氣物質(表2)進行后續 分析。

表2 酒樣香氣物質的OAV值Table 2 OAV values of aroma components in wine samples

由圖6可以看出，3種供試樣品的香氣輪廓較為相似，主要表現為花香、果香特征。相比于迷迭香酸處理和對照組酒樣，添加咖啡酸的酒樣具有較高的花香(72.57)和果香值(188.42)，分別高出其余兩組酒樣4.13%～32.89%和8.33%～138.20%。綜合分析，添加不同酚類物質的酒樣對其香氣特征的關系表明，咖啡酸處理酒樣相比于迷迭香酸處理酒樣表現出較為濃郁的花果香味。

由主成分分析可知(圖7)，供試樣品之間有明顯的成分特征區別，特別是兩種添加酚類物質處理的酒樣，其中咖啡酸在PC2正半軸上得分較高，主要表現為酯類及萜烯類等物質，而迷迭香酸在PC1負半軸得分較高，此區域主要代表高級醇的香氣信息。進一步的聚類熱圖分析發現(圖8)，相比于迷迭香酸和對照組酒樣，添加咖啡酸的樣品與癸酸乙酯等具有水果香氣特征的物質有較高的相關性。而迷迭香酸處理酒樣與己酸乙酯、苯甲醛和苯乙醇等有較高的相關性，這些特征香氣物質可提升葡萄酒的香氣復雜性。

3 討 論

研究發現，酚類物質會改變香氣化合物的揮發性及分配系數，并伴隨有感官知覺的變化。這些反應可能與多酚成分和芳香化合物的相互作用或結合有關，從而影響其釋放與感知[25-26]。對比本試驗結果發現，迷迭香酸和咖啡酸在影響主要香氣物質積累方面表現不同，其中迷迭香酸的添加對發酵階段酯類物質的含量積累有明顯的抑制效果；而正己醇和2,3-丁二醇等醇類物質會隨咖啡酸的加入表現出顯著的抑制現象。結合上文的結果，筆者推測造成本試驗兩種酚類物質香氣影響效果不同的原因可能與其結構相關。相比咖啡酸分子的單個苯環平面，迷迭香酸分子結構中含有2個酚環基團，使得后者可以提供更大的作用表面。同時，其環平面上的多個羥基位點，也為其與香氣物質結合提供了幫助[27]。不過具體有關結構差異是如何影響香氣物質結合的問題還需做進一步的分析。此外，對于整個發酵過程而言，酚類物質對香氣化合物的影響，除可能與結合性能的差異有關外，是否也存在類似酚類物質影響發酵階段花色苷浸漬效率的現象，形成不同多酚物質對相同香氣化合物相異的浸出效果，而有關這一問題也需做進一步的研究。

4 結 論

本試驗研究酚類物質添加對‘黑比諾’干紅葡萄酒發酵階段主要香氣成分的影響，結果表明：添加咖啡酸和迷迭香酸的葡萄酒其基本理化指標均符合國標要求。分析發酵階段主要香氣物質變化發現，隨發酵時間的延長，類別相同的物質在整個發酵過程中具有相似的變化趨勢，且各類香氣物質隨酒精發酵的進行含量逐漸積累，但在蘋-乳發酵階段其濃度呈一定的下降趨勢。其中添加咖啡酸可明顯增加葡萄酒中乳酸異戊酯、苯乙醇和α-松油醇等香氣物質的含量，而添加迷迭香酸顯著增加2,3-丁二醇等物質的含量。

香氣輪廓模擬表明，咖啡酸處理酒樣呈現濃郁的花香和果香，而迷迭香酸處理酒樣的整體香氣特征較差。同時，主成分和聚類熱圖分析結果顯示，咖啡酸處理酒樣與乙酸乙酯、辛酸乙酯、香葉醇和β-大馬士酮等主要酯類、萜烯類及C13-降異戊二烯類香氣物質的含量具有較高的相關性。