桃PpNCED家族成員鑒定與表達特性分析

張澤華，萬淑媛，李 琴，劉福云，趙彩平

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

桃[Prunuspersica(L.)Batsch.]果實不耐貯藏，貨架期短，是制約桃產業發展的主要問題之一。因此，研究桃果實的成熟軟化調控機制對延長貯藏期十分重要。

植物激素ABA對果實的成熟軟化具有重要的調控作用。研究表明，ABA可以通過調控乙烯、細胞壁、生長素和糖酸代謝相關基因來調控果實的成熟軟化[1-2]。Zhang等[3]對桃和葡萄的研究顯示，ABA主要在果實的成熟啟動階段起重要調控作用，但Jacqueline等[4]在鱷梨中的研究表明，ABA的高峰出現在乙烯高峰之后。

9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED)是ABA合成途徑中的限速酶，對于ABA的合成至關重要[5-7]。NCED家族成員已在多個物種上被鑒定出來，且在進化上較為保守[3,5,7-10]。值得注意的是，NCED家族成員中不是每個都與ABA合成相關。比如，擬南芥上鑒定出的9個NCED成員，只有5個與ABA合成相關[5]。在鱷梨上，NCED2為組成型表達，由于缺乏葉綠體轉運肽，所以很可能不參與ABA的合成[4]。

NCED對于果實的成熟具有重要的作用。在番茄上，沉默SlNCED1會延緩果實成熟進程，使果實無法正常著色，質地相關基因被下調[11]。此外，NCED基因表達也會受到外源ABA調節劑的影響。比如，外源ABA處理可以顯著提高草莓、櫻桃NCED基因的表達水平[12-13]。但有意思的是，在番茄上，外源ABA不會影響內源ABA的積累和NCED的表達水平[3]，說明不是所有的NCED都會響應外源ABA。另外，沉默ABA代謝基因SlCYP707A2會導致SlNCED1表達水平上升，表明ABA在番茄體內可能存在負反饋調節網絡[11]。而在黃瓜果實未熟期噴施ABA，對黃瓜果實成熟沒有明顯的影響，但在轉色期噴施則可以使CsNCED1、CsNCED2基因的表達水平升高[14]。說明NCED響應外源ABA可能與果實所處生理階段有關。近年來，關于桃上NCED的研究有一些報道，但不系統。首先，桃NCED基因是否響應外源ABA，Soto等[1]的研究表明，NCED對外源ABA的響應特性取決于桃果實發育的生理階段。其次，ABA如何調控桃果實的成熟，Wang等[15]的研究顯示，PpERF3可以結合在NCED2/3的啟動子上，正向調控NCED2/3的基因表達，說明乙烯與ABA可能協同調控桃果實的成熟。此外，桃上的NCED家族成員的系統鑒定還未見相關報道。NCED成員在不同桃品種之間是否存在不同的表達特性？不同的NCED成員之間對外源ABA的響應是否一致？這些問題都還未解決。

因此，本研究鑒定桃中的NCED家族成員，并分析其在不同器官、果實不同發育階段以及在不同耐貯性桃果實中的表達特性，以期明確與桃果實成熟可能相關的NCED基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以桃栽培品種‘淺間白桃’(QJBT)，‘秦王’(QW)和‘美秋’(QM)為試材，種植于西北農林科技大學桃種質資源圃。

不同組織樣品的采集：以‘淺間白桃’品種為試材，采集根(須根，直徑2 mm左右)、莖(新梢)、葉(1 a生新梢上第2～4片成熟葉)、花(未完全展開的花)、果實(幼果)。

果實發育期樣品的采集：以‘秦王’桃品種為試材，采集花后65 d、95 d和110 d的桃果實。

不同耐貯性果實樣品的采集：采摘處于商品成熟期的不耐貯藏的‘淺間白桃’和極耐貯藏的‘秦王’桃果實。‘淺間白桃’果實在采收當天及貯藏過程中每隔2 d取樣，‘秦王’每隔4 d取樣。

1.2 試驗處理

ABA處理及樣品采集：以‘美秋’為試材，在果實采收前一周，選擇樹型、長勢、樹齡一致的3棵桃樹，在每棵樹的2個主枝上，分別用50 μmol/L的ABA和清水噴施，每隔3 d噴施1次，共噴施2次。在商品成熟期采收果實，在采收當天及貯藏過程中每隔2 d取樣。

1.3 試驗方法

1.3.1 桃NCED基因家族成員鑒定與生物信息學分析 在擬南芥基因組數據庫(TAIR)下載所有的擬南芥NCED基因，以擬南芥AtNCED的基因序列在NCBI tblastn用于搜索桃基因組數據庫，桃基因的完整氨基酸序列從薔薇科基因組數據庫(GDR)中獲得。所有檢索出的基因(E-value≤ 0.005)都利用DNAMAN軟件進行多重序列比對并使用保守結構域進行分析，刪除不含保守結構域的基因。使用SignalP 4.1Server分析信號肽。利用在線程序ExPASy ProtParam對PpNCED基因編碼蛋白的等電點和分子量進行分析。使用MapDraw軟件將基因定位到染色體，根據其在染色體上的位置對其進行命名。系統進化樹用MEGA 6.0軟件進行構建，采用鄰接法(NJ)，重復1 000次。

1.3.2 RNA提取和實時定量熒光PCR(qRT-PCR)分析 采用CTAB法提取RNA，通過凝膠電泳檢測總RNA的完整性，用紫外分光光度計來檢測OD260、OD280值，從而判斷RNA的純度和濃度。

表1 桃NCED基因家族定量引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR analysis of peach NCED genes family

1.4 數據處理

用Excel 2010和Spss 22對試驗數據進行處理和統計分析，用Excel 2010繪圖。

2 結果與分析

2.1 桃NCED基因家族成員的鑒定和生物信息學分析

2.1.1 桃NCED基因家族成員的鑒定 共鑒定出7個桃NCED基因家族成員：prupe.1G061300.1，prupe.1G255500.1，prupe.1G255500.2，prupe.2G014700.1，prupe.2G014700.2，prupe.4G082000.1，prupe.4G150100.1。所有成員均含有高度保守的視網膜色素上皮膜蛋白結構域RPE65(圖1-a)。根據其染色體定位，分別命名為PpNCED1、PpNCED2a、PpNCED2b、PpNCED3a、PpNCED3b、PpNCED4和PpNCED5。NCED基因家族成員分布在3條桃染色體上，一號染色體上有3個PpNCED基因，二號和四號染色體上各有2個PpNCED基因(圖1-b)。7個NCED家族成員均無信號肽，PpNCED1～PpNCED5編碼的氨基酸長度為427～632 aa，預測蛋白的等電點為5.64～7.24，分子質量為47.30～70.35 ku (表2)。

表2 NCED蛋白理化特性Table 2 Physical and chemical properties of NCED protein

2.1.2 基因系統進化樹分析 將桃、蘋果、葡萄、柑橘、櫻桃、梅、擬南芥上已報道的NCED基因構建系統進化樹。結果表明，PpNCED1與梅PmNCED6同源性最高；而PpNCED2a、PpNCED2b與擬南芥的AtNCED4高度同源，PpNCED3a、PpNCED3b與擬南芥的AtNCED1同源性較高；PpNCED4與櫻桃PacNCED5基因同源性最高；PpNCED5與梅PmNCED1高度同源。此外，根據擬南芥上NCED基因家族成員的分類，將桃上的NCED基因分為兩個亞家族。其中，PpNCED1、PpNCED4、PpNCED5屬于亞家族Ⅰ；PpNCED2a、PpNCED 2b、PpNCED3a、PpNCED3b屬于亞家族Ⅱ(圖1-c)。

2.2 桃NCED基因家族成員組織特異性分析

如圖2所示，5個基因在不同的組織部位表達情況各不相同。其中，PpNCED1只在莖、葉中有表達。PpNCED2、PpNCED3均表現出在花中的表達量較高，在葉和莖中有少量表達，在根和幼果中表達量較低。PpNCED4在莖和花中表達量較高，在幼果中次之，在葉中表達量較低。PpNCED5在莖中大量表達，其次為根、花、幼果，在葉片中表達量較低。

2.3 果實發育期間NCED基因家族成員表達特性分析

為了研究NCED基因家族成員在桃果實發育階段中可能的作用，選取‘秦王’品種，分析花后65 d至果實成熟期NCED成員相對表達量的差異。圖3結果顯示，在花后65 d，果實中幾乎檢測不到PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5的表達豐度，而其后隨著果實的膨大和成熟，PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5均呈上調表達趨勢，且在果實成熟期達到表達高峰。

2.4 不同耐貯性桃果實成熟軟化期間NCED基因家族成員表達特性分析

為了研究NCED基因家族成員在桃果實成熟軟化中可能的作用，本研究分析‘淺間白桃’‘秦王’和‘美秋’果實采后貯藏期間NCED成員相對表達量的差異。圖4結果顯示，在不耐貯桃‘淺間白桃’和耐貯藏的‘秦王’果實的采后貯藏期間，PpNCED2的相對表達量均呈緩慢下降趨勢，且在采收當天表達量最高。而PpNCED3在‘淺間白桃’中的相對表達量從采后0～2 d先下降，第2天開始逐漸上升，在第6天達到表達高峰。PpNCED4、PpNCED5在‘淺間白桃’果實貯藏期間幾乎檢測不到表達量(圖4)。

PpNCED3、PpNCED4在‘秦王’果實貯藏期間的表達模式相似，均為雙峰曲線。PpNCED3的第一個表達高峰在采后第12天，第二個表達高峰在采后第24天。PpNCED4在采后第4天達到第一個表達高峰，此后迅速下降，在采后第20天達到第二個表達高峰。而PpNCED5在‘秦王’果實采收當天表達量最高，之后逐漸下降，到采后第20天后呈緩慢上升趨勢(圖4)。

在‘美秋’果實采后貯藏期間，PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5整體均呈上調表達趨勢，PpNCED2、PpNCED3的表達量在貯藏的前2 d迅速升高，后呈下降趨勢，PpNCED3在貯藏末期表達量又升高。PpNCED4、PpNCED5表達量的變化趨勢較一致，均在采后的0～4 d表達量逐漸上升，在第4天后又均呈下降趨勢(圖5)。

試驗結果還表明，在不同桃品種果實中，NCED家族成員的表達豐度存在差異。PpNCED2在‘秦王’和‘美秋’果實貯藏期間的整體表達量顯著高于‘淺間白桃’；而PpNCED3在‘秦王’果實中的整體表達量低于‘淺間白桃’和‘美秋’。

2.5 外源ABA處理后桃成熟軟化期間生理指標變化及NCED基因家族成員的響應特性

為了進一步探究NCED基因家族成員在桃果實成熟軟化期間對外源ABA的響應特性，對‘美秋’桃進行外源ABA處理。結果顯示，外源ABA處理后，貯藏期間桃果實硬度始終低于對照果實，且在采后0 d和2 d差異顯著。此外，ABA處理和對照果實均表現出從貯藏0～4 d乙烯釋放量緩慢升高，4 d～6 d迅速升高并出現峰值，且外源ABA處理果實的乙烯釋放高峰顯著高于對照。外源ABA處理后，在采收當天，PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5的表達均被顯著促進；在貯藏第2天，PpNCED4、PpNCED5的表達量也顯著高于對照果實；而PpNCED2、PpNCED3在貯藏第2～4天的表達量被顯著抑制(圖5)。總的來說，在貯藏前期，NCED家族成員表達量呈現出被外源ABA上調的趨勢，而中后期整體呈現下調的趨勢。

3 討 論

桃果實深受消費者的喜愛，但其容易軟化腐爛是制約商品價值的重要原因。因此，關于桃果實成熟軟化的調控始終是一個研究熱點。ABA可以促進果實的成熟軟化，而NCED作為ABA合成途徑中的限速酶，在該調控途徑中尤為關鍵[5-7]。許多物種中已經鑒定出了NCED基因家族成員，且各物種中的家族成員數目不同，這可能與染色體加倍有關[5,16-17]。在本研究中，共鑒定出7個NCED基因，并發現它們都在NCED的第一和第二亞家族內。在桃中關于NCED的研究報道大都聚焦于NCED第一亞家族的成員[1,15,18]，即本研究中鑒定出的PpNCED1、PpNCED4、PpNCED5。第二亞家族的成員相關報道較少。

系統進化樹結果表明，PpNCED1與葡萄VvNCED6和擬南芥的AtNCED6的同源性較高。VvNCED6可能參與調控葡萄的花色苷的積累[19]；而AtNCED6與擬南芥種子休眠相關[20]。在本研究中，PpNCED1在果實中幾乎不表達(圖2)，說明PpNCED1可能不參與桃果實的成熟調控。PpNCED4與草莓FaNCED1同源性較高，FaNCED1在調控草莓果實成熟中發揮重要作用，沉默FaNCED1導致草莓內源ABA水平降低及果實的不著色表型[21]。本研究中，PpNCED4在‘秦王’和‘美秋’成熟軟化期間均呈上調表達趨勢(圖4，圖5)，說明其可能與桃果實成熟相關。PpNCED5與櫻桃的PacNCED1高度同源，PacNCED1在櫻桃果實成熟過程中具有重要作用[13]，由此可以推斷桃PpNCED5也可能與桃成熟密切相關。

此外，本研究結果顯示，NCED基因家族成員的表達具有明顯的組織特異性，這與甜櫻桃中的研究結果相似[22]。在果實中表達的NCED基因家族成員數目在不同品種間也存在差異，在不耐貯藏的‘淺間白桃’果實中，只有PpNCED2、PpNCED3表達，而在極耐貯藏的‘秦王’果實和較耐貯藏的‘美秋’果實中，除PpNCED1外，其他NCED成員均有一定表達量(圖4，圖5)。

不同NCED成員在桃果實發育與成熟軟化過程中的表達模式既有相似之處，也存在差異。在果實發育過程中，PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5均表現出隨果實發育表達量升高，在成熟期達到表達高峰(圖3)；在果實貯藏期間，PpNCED2、PpNCED5的表達量均呈下降趨勢(圖4)。番茄SlNCED1、柿子DkNCED1和甜櫻桃PacNCED1的表達量也表現出在果實綠熟期增加，在成熟轉變期達到高峰，后熟期迅速下降的趨勢[11,13,23]。而PpNCED2、PpNCED5在‘美秋’的成熟期間呈現出先升后降的趨勢，表明不同品種間的表達模式存在差異(圖5)。在‘秦王’和‘美秋’貯藏期間，PpNCED3、PpNCED4的表達量均表現出較為一致的雙峰曲線變化趨勢，且伴隨著表達量高峰的出現，果實硬度迅速下降，因此，其可能與果實軟化相關(圖4，圖5)。

已有研究表明，ABA對NCED基因表達的調控與果實所處的發育階段有關。在桃果實膨大期(S3中期)噴施ABA，會抑制NCED基因的表達，而在S3/S4和S4時期，ABA處理后NCED基因表達量被上調[1]。在黃瓜果實未熟期噴施ABA對黃瓜果實成熟沒有明顯的影響，而在轉色期噴施則上調CsNCED1、CsNCED2基因的表達水平，促進黃瓜果實的成熟[14]。本研究結果顯示，在果實成熟前1周，外源噴施ABA后，果實硬度顯著降低，乙烯釋放峰值顯著升高，表現出對果實成熟有顯著的促進作用。外源ABA處理后，均表現出在貯藏早期顯著促進PpNCED家族成員的表達，而在貯藏中后期顯著抑制PpNCED家族成員的表達，可能是負反饋調節的結果(圖5)。植物體內的激素水平需要保持穩態，比如，乙烯處理番茄可以通過上調SlACS2、SlACS4和下調SlACS6的轉錄來正向或負向調節乙烯的生物合成[24]。果實內ABA的生物合成是否也存在這種調節機制還有待進一步研究。