利用流式細胞術鑒定杏及其部分近緣植物的倍性

楊 麗，孫浩元，張俊環，閆愛玲，姜鳳超，張美玲，王玉柱

(1.北京市林業果樹科學研究院,北京 100093；2.北京市落葉果樹工程技術研究中心，北京 100093；3.國家林業和草原局杏工程技術研究中心，北京 100093)

杏是原產中國的古老果樹樹種，目前廣泛分布于世界各地，種質資源十分豐富，據統計，世界上的杏約有10～12個種[1]，被用作鮮食、仁用、觀賞、砧木等多種用途。杏和李同為薔薇科(Rosaceae)李屬(PrunusL.)植物，親緣關系近，在長期生長、進化和栽培利用過程中，二者之間形成了許多天然或人工雜交種質。如紫杏(P.dasycarpaEhrh.)是以櫻桃李(P.cerasiferaEhrh.)為母本與普通杏(P.armeniacaL.)種間雜交天然形成[2]，杏李是李與普通杏多代雜交選育而來[3-5]。牟蘊慧等[6]利用李杏遠緣雜交育成杏新品種‘龍園甜杏’。現有研究表明杏為二倍體[7-9]，而不同種的李則有倍性的差異，中國李(P.salicinaLindl.)、美洲李(P.americanaL.)、櫻桃李、烏蘇里李(P.ussuriensisKov.&kost)、杏李 (P.simoniiCarr.)(不同于遠緣雜交杏李)為二倍體、黑刺李(P.spinosaL.)為四倍體、歐洲李(P.domesticaL.)為六倍體[10]。果樹多倍體具有生長旺盛、果實大且少籽或無籽、產量高、適應性和抗性強等特點，且能夠利用無性繁殖的方式固定其優良性狀，使之保持穩定而不分離，在生產上長期利用，因此果樹多倍體的發掘、培育與利用是果樹育種的重要內容[11]。果樹多倍體可以通過自然變異、人工誘導或有性雜交產生。蒲富慎等[7]和林盛華等[8]用染色體計數法對150個李品種和422個杏品種進行倍性鑒定，發現來自高寒地區的2份中國李三倍體種質資源和1份三倍體杏種質資源‘泰安杏梅’；蘋果、梨、棗、山楂等果樹樹種中均有通過自然變異選育出的多倍體品種[11]。

多倍體砧木能夠誘導嫁接植株矮化，提高植株對干旱、低溫、缺鐵、鹽害及重金屬等非生物脅迫的耐受能力[12]。由于砧木對果樹生長、適應性、抗性、果實品質和產量等具有諸多重要影響[13]，在過去的30余年里，發達國家核果類果樹栽培從利用實生砧木向重視無性系砧木轉變[14]，加速了遠緣雜交種和李屬其他種作為桃、杏、李、櫻桃等核果類果樹樹種砧木的應用，一些易于無性繁殖且具有矮化作用的李、杏砧木得到廣泛應用[15]。中國李、杏砧木研究起步較晚，與世界發達國家差距較大，生產上長期沿用普通杏、山杏、山桃和李等實生砧木，缺乏無性系砧木良種，生產的果品商品性不高，制約了產業的發展[16]。為此，北京市林業果樹科學研究院從歐洲引進了一批具有矮化、易無性繁殖、適應性強等特性的李杏砧木。

流式細胞術(Flow cytometry, 簡稱FCM)是20世紀70年代發展起來的一種集激光技術、光電測量技術、計算機技術、流體力學以及細胞免疫熒光化學技術為一體的細胞分析技術，目前已經廣泛應用于細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學等多個研究領域[17]。植物倍性鑒定是植物資源評價的重要內容，對于植物資源的開發利用具有重要意義。在植物倍性鑒定研究中，流式細胞術與傳統染色體計數法、形態觀察法相比，具有操作技術簡單、用時短、效率高、鑒定結果準確等特點，因此，自1987年Delaat等[18]首次報道使用流式細胞術鑒定植物倍性以來，該方法已成為鑒定植物倍性的常用方法[19]，中國許多學者利用流式細胞術對不同樹種進行了倍性鑒定研究。如韓莎等[20]對不同倍性桑樹品種及經過秋水仙堿或60Co-γ射線誘導的桑樹誘變植株進行倍性鑒定，并與染色體計數結果進行比較；趙奉彬等[21]進行11種楊屬植物的倍性鑒定，并確定了山楊天然三倍體；趙青等[22]確定5種木蘭科植物的DNA-C值及其倍性；此外，流式細胞術也被應用于蘋果[23]、獼猴桃[24]、桃[25]、梨[26-27]和香蕉[28-29]等果樹樹種及櫻桃砧木[30]的倍性鑒定。

本研究以150份杏、7份李和9份引進李杏砧木資源為試材，利用流式細胞術開展倍性鑒定，以明確其倍性水平，發掘多倍體資源，為進一步開展相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以150份杏(編號1-150)、7份李(編號151-157)、9份引進砧木(編號158-166)種質資源幼嫩葉片為試材，采集生長季節新梢頂部初展葉片，分別用自來水和蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分，備用。所有材料均采自北京市林業果樹科學研究院杏和李種質資源圃，栽培管理水平一致。150份杏資源包括普通杏及其變種、西伯利亞杏及其變種、仁用杏、紫杏和遼杏等種質類型；7份李資源包括杏李、黑刺李和歐洲李等種質類型；9份砧木資源包括烏荊子李、遠緣雜交種質和未知類型種質。

1.2 試驗方法

2 結果與分析

2.1 流式細胞術鑒定150份杏樣品DNA相對含量與倍性水平

以二倍體‘巴斗’為外標，利用流式細胞術對150份杏種質資源進行倍性鑒定結果見表1。由表1可知，供試150份杏樣品CV值為1.80～ 5.10，數據質量較好；G0/G1期熒光強度峰值 36.81～56.39，DNA相對含量77.07%～ 118.07%，樣品與對照G0/G1期熒光強度峰值比值均近似1，全部為二倍體。

表1 以二倍體‘巴斗’為參照的150份杏種質資源的FCM分析Table 1 FCM analysis of 150 accessions of apricot germplasm resources with diploid ‘Badou’ as external reference

(續表1 Continued table 1)

(續表1 Continued table 1)

2.2 流式細胞術鑒定16份杏近緣植物種質資源DNA相對含量與倍性水平

以‘巴斗’為外標，利用流式細胞術對16份杏近緣種質資源進行倍性鑒定，結果見表2。由表2可知，供試16份樣品CV值為1.80～4.65，數據質量較好；G0/G1期熒光強度均值為36.38～162.83， DNA相對含量為76.17%～ 340.93%，其中杏李品種‘坤洛紅美’、雜交杏李品種‘味帝’‘味厚’‘風味玫瑰’及李杏砧木品種‘HY-KL-A’‘KR.’‘PU.’‘ISHTRAR’‘L2’的G0/G1期熒光強度峰值與‘巴斗’相近，位于橫坐標50左右位置，其倍性水平與‘巴斗’相同，為二倍體；李杏砧木品種‘JASPI’的G0/G1期熒光強度峰值位于橫坐標100左右，其倍性水平是‘巴斗’的二倍，為四倍體；歐洲李品種‘VALOR’‘OULINSKA’、黑刺李及李杏砧木品種‘ FE.’‘GF655-2’和‘S2’的G0/G1期熒光強度峰值位于橫坐標150左右，其倍性水平是‘巴斗’的三倍，為六倍體。

表2 以二倍體‘巴斗’為參照的16份杏近緣種的FCM分析Table 2 FCM analysis of 16 accessions from wild relatives of apricot with diploid ‘Badou’ as external reference

部分樣品熒光強度直方圖結果見圖1。圖1中直方圖每個通道的核數量，直觀地反應了相對的熒光強度值，同時表示每個樣品的DNA相對含量。圖中橫坐標代表DNA相對含量，縱坐標代表細胞核數量。圖1-a為流式細胞術對二倍體杏品種‘巴斗’鑒定結果，可見其G0/G1期峰值位于橫坐標50左右位置；圖1-b、1-c、1-d分別為‘味帝’‘坤洛紅美’和‘L2’流式細胞術鑒定結果， G0/G1期峰值在橫坐標位置均與‘巴斗’相近，為二倍體；圖1-e為‘JASPI’流式細胞術鑒定結果， G0/G1期峰值在橫坐標100左右位置，是對照‘巴斗’的二倍，為四倍體；圖1-f為‘S2’ 流式細胞術鑒定結果，G0/G1期峰值在橫坐標150左右位置，是對照‘巴斗’的三倍，為六倍體。

3 討論與結論

3.1 對照樣品與試驗材料選擇

應用流式細胞術(FCM)進行常規的倍性鑒定分析時，多采用外標(External reference/Separate standard)，即參照樣本獨立檢測，參照樣本一般應滿足倍性已知、與目標樣本染色體結構相似兩個條件[32]。本研究選擇杏品種二倍體‘巴斗’為參照樣本，應用流式細胞術鑒定出150份杏及16份杏近緣植物種質資源倍性。

關于試驗材料，利用流式細胞術進行倍性鑒定多選擇分生能力強、雜質含量相對較少、比較容易取得的植物器官，如組培苗、莖尖、休眠枝條水培獲得的嫩葉等。本研究選用田間自然生長的幼嫩葉片，材料供應時間長、數量多、取材容易；因為實驗室距離采樣地點近，所有材料均是即采即清洗后即用，檢測時碎片峰少、熒光強度峰清晰，效果較好。若檢測樣本量大、采樣地點距離遙遠，試驗材料需要低溫保存，但保存時間不宜過長[9]。

3.2 利用流式細胞術鑒定植物倍性水平結果的判斷

目前，利用染色體計數法鑒定植物倍性水平最為直接、可靠，但是該方法對試驗材料、操作技術都有較高要求，且過程繁瑣、效率較低；利用流式細胞術進行倍性鑒定，可以短時間內完成較多樣本檢測，大大提高了工作效率，且通過前人對桑[20]、蘋果[23]、櫻桃砧木[30]等樹種應用染色體計數法與流式細胞術倍性鑒定結果進行比較，證明了后者的可靠性。

但是用于流式細胞術的試驗材料多為生長、分裂旺盛的植物器官，如嫩葉，應用流式細胞術進行倍性檢測時，其G2/M期熒光強度峰值 G0/G1期2倍熒光強度峰值重疊，造成混倍體的假象，影響對樣本倍性的判斷。為此，本研究通過增加樣本檢測重復次數、增加每次檢測細胞數量以及與對照樣品峰值的比較等措施來判斷檢測樣本的倍性，提高了準確性。

3.3 杏及其近緣植物倍性鑒定與多倍體砧木的發現

蒲富慎等[7]觀察普通杏和西伯利亞杏2個類型的18份杏種質資源染色體數目，皆為二倍體；林盛華等[8]利用染色體計數法對中國5個種422份杏種質資源進行倍性鑒定，發現除‘泰安杏梅’為三倍體外，其他均為二倍體，而后續研究[10,33]證明‘泰安杏梅’為李與杏的雜交種質,且與李的親緣關系更近；李雯雯等[9]用流式細胞術進行新疆野杏兩個居群20份樣品的倍性鑒定，供試樣品均為二倍體。本研究用流式細胞術對來自中國東北、華北、西北生態群及日本、美國和歐洲的150份杏種質資源進行倍性鑒定，供試樣品皆為二倍體，沒有發現多倍體或嵌合體資源。本研究與前人研究[7-10.33]相比，試驗材料地理分布更廣泛、基因型更豐富。

蒲富慎等[7]觀察16份李種質資源染色體數目，結果表明只有歐洲李品種‘晚黑’為六倍體，其余包括中國李、美洲李、櫻桃李、烏蘇里李和沙櫻李×歐洲李等5個類型的15份資源均為二倍體。本研究所用7份李資源中，2份歐洲李為六倍體，1份杏李為二倍體，與前人報道[2,10]一致；1份黑刺李資源為六倍體，與前人報道[2,10]不同，可能是供試材料個體差異導致，其原因有待進一步明確；3份以李與普通杏多代人工雜交獲得的杏李資源均為二倍體，此前未見對該類型李資源倍性鑒定報道。據報道，3個杏李品種‘味厚’[3]‘味帝’[4]和‘風味玫瑰’[5]都是歐洲李與普通杏的雜交后代，本研究結果證明這一觀點是錯誤的：歐洲李為六倍體、普通杏為二倍體，其后代不應為二倍體；歐洲李遺傳基礎狹窄，不易與其他李種雜交[10]，與杏雜交更困難，因此引進杏李資源的親本有待進一步明確。

本研究通過對9份引進的李杏砧木資源的倍性鑒定，發現4份多倍體資源，未來經過進一步研究，比如觀察它們在中國不同地區的表現、適應性、與栽培品種嫁接親和性及對生長結果的影響等，有望對中國李、杏矮化密植和抗逆栽培起到積極作用，進而促進產業發展。