青稞 HvnPHO1;2基因克隆、亞細胞定位和表達模式分析

任晴雯，安立昆，姚有華，姚曉華，劉凡語，吳昆侖

(1.青海大學，西寧 810016；2.青海省農林科學院，西寧 810016；3.青海省青稞遺傳育種重點實驗室/國家麥類改良中心青海青稞分中心，西寧 810016)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)，是青藏高原地區最重要的糧食和飼料作物之一，是高原農業文明的象征。長期的進化和人工培育使得青稞適應了高原地區高寒、貧瘠、干旱、強紫外線等極端惡劣氣候，是青藏高原海拔2800m以上地區唯一能正常生長的糧食作物，青稞的生產直接影響著藏區的糧食安全和經濟發展[1-2]。磷元素是作物正常生長發育不可缺少的三大營養元素之一，對于作物生長發育、抗性、產量、品質都有直接影響。土壤中的磷易與陽離子螯合形成難溶化合物，雖然很多土壤中富含磷元素，但是能夠供植物吸收利用的土壤有效磷的含量很低，這使得磷肥的利用效率遠低于氮和鉀[3-4]。在中國大多數耕地中都普遍存在磷元素缺乏和作物磷利用率低的問題，而長期過量施用磷肥會引起更嚴重的農業生態災難[5]。研究磷高效利用基因，提高作物對土壤中磷的利用率，是實現生態農業可持續發展的重要途徑之一[6]。青稞的主要栽培地區大多地處高原，生態環境極為敏感脆弱，對過量化肥施用引起的生態環境問題更為敏感，尤其是青藏高原地處三江源頭在全國具有特殊的生態地位，青藏高原的農業生態環境保護直接關系到青藏高原地區的經濟發展。近年來青藏高原地區開展以生態文明統領經濟發展，農業生產實施化肥減量增效戰略。克隆和研究青稞磷高效利用相關基因對研究青稞耐低磷機制以及利用分子育種技術培育耐低磷青稞品種具有重要意義，有助于減少化肥的施用，降低農業生產成本，保護生態環境。對促進青藏高原地區乃至全國青稞栽培區域的生態農業發展具有重要意義。

植物對磷的吸收和轉運主要依靠磷轉運蛋白來完成，植物中磷轉運蛋白分為高親和磷轉運蛋白和低親和磷轉運蛋白，高親和磷轉運蛋白受低磷快速誘導特異性表達，低親和磷轉運蛋白是組成性表達[7-9]。目前植物磷轉運蛋白研究主要集中在PHT1、PHT2、PHT3、PHO1和PHO2五大家族。植物體中磷從地下往地上的長距離運輸主要依賴PHO1家族磷轉運蛋白，PHO1是第一個被鑒定出能夠將磷從植物器官流出的磷轉運蛋白，PHO1家族轉運蛋白主要在根中柱細胞中表達，負責將磷裝載到木質部，還可以吸收磷進入到細胞，在植物磷運輸和磷動態平衡過程中發揮著極為重要的作用[10-13]。Ma等[14]對水稻OsPHO1;2進行研究，發現OsPHO1;2介導苗期根和莖組織之間的磷轉運，同時具有內流和外排活性，并以外排活性為主，OsPHO1;2并不參與細胞內的磷轉運過程，而是作為外運蛋白將磷從細胞中釋放出來。目前，關于植物磷轉運蛋白PHO1家族的研究主要集中在擬南芥和水稻等模式植物中，其他植物中的研究報道較少，尤其是青稞中尚未見研究報道。本研究從青稞‘昆侖14’中克隆得到磷轉運蛋白基因HvnPHO1;2，對其基因結構和啟動子區域元件、該基因編碼蛋白的蛋白理化性質、跨膜結構、信號肽、二、三級結構進行了預測分析，對其他植物中的同源蛋白序列進行序列比對并構建系統進化樹進行分析。此外還對其亞細胞定位和表達模式進行了分析。關于青稞中磷吸收利用相關基因研究報道極少，克隆和研究青稞磷高效吸收利用相關基因對研究青稞耐低磷機制以及利用分子育種技術培育耐低磷青稞品種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青稞品種‘昆侖14’和本氏煙草(Nicotianabenthamiana)由青海省青稞遺傳育種重點實驗室保存。DNA提取采用天根生化科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒DP305。KOD-FX高保真PCR酶和熒光定量PCR試劑盒TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(QPS-201)購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。TransZol Up Plus RNA提取試劑盒和PCR產物連接及cDNA合成試劑盒EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(AE301-03)購自全式金生物技術有限公司。限制性內切酶XbaⅠ和KpnⅠ購自NEB公司。大腸桿菌感受態為自制DH5α感受態。引物合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 青稞DNA提取和cDNA合成 青稞品種‘昆侖14’種植于青海大學農林科學院實驗溫室內。待其長至3葉期時，摘取葉片提取DNA和RNA。參照天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒DP305說明書提取青稞葉片基因組DNA，參照全式金生物技術有限公司TransZol Up Plus RNA提取試劑盒提取的RNA，并參照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix cDNA合成試劑盒合成 cDNA，所有樣品放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 引物設計 PCR引物參照表1。

表1 引物序列Table 1 The primers

1.2.3 青稞HvnPHO1;2基因克隆 在植物基因組數據庫Gramene(http://www.gramene.org/)中搜索獲得大麥HvPHO1;2(HORVU6Hr1G089130.12)基因信息，并根據HvPHO1;2基因和啟動子區域序列設計引物，采用KOD-FX高保真PCR酶從青稞品種‘昆侖14’ cDNA中擴增出青稞HvnPHO1;2基因片段，從DNA中擴增出啟動子區域片段。擴增程序為： 10× PCR緩沖液12.5 μL dNTP Mixture(25 mmol/L) 5.0 μL，正反向引物(20 μmol/L)各 1 μL，模板DNA 1.0 μL，KOD-FX酶(5 U/μL)0.5 μL， ddH2O 4.0 μL，共25 μL。以提取的青稞DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應程序為：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 2.5 min，35個循環；4 ℃保存。反應完畢，取5 μL PCR產物在含EB的10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下檢測。將PCR產物與pEASY-Blunt Cloning載體混合參照說明書進行連接并轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆并送測序。

1.2.4 青稞HvnPHO1;2基因生物信息學分析 在植物基因組數據庫Gramene(http://www.gramene.org/)中獲得基因結構信息。利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動子元件。利用蛋白理化性質分析網站(https://web.expasy.org/protparam/)分析理化性質。利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析跨膜結構。利用SignalP(http://www.Cbs.Dtu.Dk /services /SignalP/)分析蛋白信號肽。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)中分析蛋白二級結構。利用Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)進行同源建模生成三級結構預測圖。在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索得到擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtPHO1;2、大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)GmPHO1;2、水稻(OryzasativaL.)OsPHO1;2、玉米(ZeamaysL.)ZmPHO1;2、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdPHO1;2、番茄(Solanumlycopersicum)SlPHO1;2、甘藍型油菜(BrassicanapusL.)的蛋白序列，采用DNAMAN7.0與大麥和青稞HvnPHO1;2蛋白序列進行比對，并根據NCBI提供的蛋白信息分析保守結構域和關鍵氨基酸位點。在植物基因組數據庫Gramene(http://www.gramene.org/)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索得到二型花(Dichantheliumoligosanthes)DoPHO1;2、OsPHO1;2、蘿卜(Raphanussativus)RsPHO1;2、醉蝶花(Tarenayahassleriana)ThPHO1;2、橡膠樹(Heveabrasiliensis)HbPHO1;2、木薯(Manihotesculenta)MePHO1;2、麻瘋樹(Jatrophacurcas)JcPHO1;2、蓖麻(Ricinuscommunis)RcPHO1;2、毛果楊(Populustrichocarpa)PtPHO1;2、可可樹(Theobromacacao)TcPHO1;2、榴蓮(Duriozibethinus)DzPHO1;2、棉花(Gossypiumhirsutum)GhPHO1;2、木槿(Hibiscussyriacus)HsPHO1;2、茶(Camelliasinensis)CsPHO1;2、芝麻(Sesamumindicum)SiPHO1;2、煙草(NicotianatabacumL.)NtPHO1;2、野草莓(Fragariavescasubsp.vesca)FvPHO1;2、桃(Prunuspersica)PpPHO1;2、狹葉羽扇豆(Lupinusangustifolius)LaPHO1;2、花生(Arachisipaensis)AiPHO1;2、木豆(Cajanuscajan)CcPHO1;2、白菜型油菜(Brassicarapa)BrPHO1;2、蘆筍(Asparagusofficinalis)AoPHO1;2、小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris)PePHO1;2、油棕(Elaeisguineensis)EgPHO1;2、海棗(Phoenixdactylifera)PdPHO1;2、山羊草(Aegilopstauschiisubsp.tauschii)AtsPHO1;2、羊黍(Panicumhallii)PhPHO1;2、高粱(Sorghumbicolor)SbPHO1;2以及HvnPHO1;2的蛋白序列輸入MEGA7中以最大似然法構建系統進化樹。

1.2.5 亞細胞定位表達載體構建 根據HvnPHO1;2cDNA序列以及pBI221-GFP載體多克隆位點設計引物(表1)，并在其正向和反向引物上分別加上XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點和保護堿基，使用高保真酶KOD-FX擴增該片段，反應程序為：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s， 56 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min 30 s，35個循環；4 ℃保存。反應完畢，取 5 μL PCR產物在含EB的10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下檢測。用XbaⅠ和KpnI對pBI221-GFP載體及PCR產物進行雙酶切，37 ℃酶切5 h后回收片段后進行混合，采用T4連接酶連接后轉化大腸桿菌感受態中。選取陽性克隆進行測序。將構建好的pBI221-HvPHO1;2::GFP載體通過凍融法轉化入農桿菌GV3101中，將制備好的菌液注射入煙草葉片中。放入溫度25 ℃，相對濕度60%，12 h光周期中培養2～3 d。將葉片剪成1 cm2大小，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 青稞HvnPHO1;2基因表達模式分析 將青稞‘昆侖14’種植于實驗溫室中，于灌漿期時，分別取旗葉、根、莖稈、籽粒、分蘗節樣品，立即放于液氮中，-80 ℃保存以備用。每個樣品至少選取3個生物學重復，分析不同部位中的HvnPHO1;2的表達情況。選取飽滿的青稞‘昆侖14’種子用84消毒液浸泡6 min后用清水沖洗5次，將種子放在鋪有濾紙的培養皿中室溫下進行萌發，5 d后選取長勢一致的幼苗固定于泡沫板中，每個泡沫板25株幼苗，放于黑色塑料盒(400 mm × 300 mm × 120 mm)中采用改良Hoagland’s培養液(1 mmol/L KH2PO4)進行培養，每個塑料盒5 L培養液。用空氣泵24 h向培養液中通入空氣，每3 d更換一次培養液，每天用1 mol/L KOH溶液穩定pH為7.0。當青稞生長至5葉期時，分別進行低磷脅迫、NaCl脅迫、ABA、MeJA、生長素NAA處理。將培養液換為低磷改良Hoagland’s培養液(10 μmol/L KH2PO4)進行低磷處理。采用含有200 mmol/L NaCl的改良Hoagland’s培養液對青稞幼苗進行鹽脅迫處理。分別配制100 mol/L的ABA、MeJA、NAA溶液，每種溶液配置200 mL并加入 0.1% Tween-20對青稞植株葉片進行均勻噴灑，對照組僅噴灑200 mL加有0.1% Tween-20的純水。以上處理都于0 h(對照)、6、12、24、48、 96 h時取葉片或根并立即放于液氮中，-80 ℃保存以備用。每個樣品至少選取3個生物學重復，分析HvnPHO1;2在不同處理下的表達模式。

采用全式金TransZol Up Plus RNA提取試劑盒，提取青稞葉、根、莖稈、分蘗節樣品的總RNA。青稞籽粒采用天根生化科技有限公司多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(DP441)提取總RNA。根據HvnPHO1;2基因的cDNA序列設計實時熒光定量PCR引物(表1)，內參基因為18SrRNA。以500 ng/μL cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR分析。反應體系為：正反向引物各1.0 μL，cDNA 2.0 μL，THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 10 μL，ddH2O 6.0 μL，共20 μL。每個反應3次重復，Ct值取平均值。根據2-△△Ct算法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 青稞 HvnPHO1;2基因和啟動子區域序列克隆

通過PCR分別擴增出片段大小為2 400 bp的基因片段和2 001 bp的啟動子區域片段(圖1)。將擴增得到的片段連接入載體pEASY-Blunt Cloning載體中采用M13引物進行測序獲得青稞HvnPHO1;2基因和啟動子區域片段。

2.2 青稞 HvnPHO1;2生物信息學分析

2.2.1 基因結構和啟動子功能元件預測分析 根據植物基因組數據庫Gramene(http://ensembl.gramene.org/genome_browser/index.html)中獲得的HvnPHO1;2(HORVU6Hr1G089130.12)的基因結構，HvnPHO1;2所對應的轉錄本含有15個外顯子和14個內含子(圖2)。將克隆得到的HvnPHO1;2基因啟動子區域序列輸入啟動子元件分析網站PlantCARE中進行分析發現除了啟動子核心元件以外還具有大量關于植物激素、脫落酸、茉莉酸順式作用元件，此外還具有低溫響應元件和種子特異性調控順式作用元件(表2)。

表2 青稞 HvnPHO1;2啟動子區域元件分析Table 2 Structure of cis-acting elements in promoter region of HvnPHO1;2 gene

2.2.2 青稞HvnPHO1;2蛋白理化性質和結構分析 通過在線軟件ProtParam分析青稞HvnPHO1;2蛋白的理化性質(表3)。該蛋白由799個氨基酸組成，分子質量為90 365.42 u，總原子數為12 735，親水系數為-0.069屬于親水蛋白，理論等電點為9.33，不穩定指數為40.18屬于不

表3 HvnPHO1;2蛋白質理化性質分析Table 3 Physical and chemical properties of HvnPHO1;2 protein

穩定蛋白，脂溶性指數為87.08。通過在線軟件TMHMM Server v.2.0網站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)對HvnPHO1;2蛋白跨膜結構域進行分析發現HvnPHO1;2蛋白具有6個跨膜結構(圖3)。采用在線軟件SignalP-5.0(http://www.Cbs.Dtu.Dk/services/SignalP/)對HvnPHO1;2進行分析發現HvnPHO1;2不具有信號肽(圖4)。采用在線軟件SOPMA分析HvnPHO1;2蛋白二級結構發現該蛋白的α螺旋(Alpha helix)、延長鏈(Extended strand)、β轉角(Beta turn)、無規則卷曲(Random coil)分別占氨基酸總數的55.94%、8.14%、 3.13%、32.79%(圖5)。采用在線軟件Swiss-Model(https://swissmodel.expasy.org/)對青稞HvnPHO1;2蛋白進行同源建模生成三級結構模型，其結構和二級結構預測結果基本一致 (圖6)。

2.2.3 HvnPHO1;2蛋白氨基酸序列對比和同源進化分析 采用DNAMAN7.0將青稞HvnPHO1;2和大麥HvPHO1;2的蛋白序列與擬南芥AtPHO1;2、大豆GmPHO1;2、二穗短柄草BdPHO1;2、番茄SlPHO1;2、煙草NtPHO1;2、油菜BnPHO1;2、水稻OsPHO1;2、玉米ZmPHO1;2進行蛋白序列對比。結果表明，蛋白都具有SPX和EXS結構域，大麥HvPHO1;2和青稞HvnPHO1;2的蛋白序列完全一致(圖7)。將青稞HvnPHO1;2與36種物種同源蛋白序列輸入MEGA7中構建系統進化樹，發現進化樹主要分為單子葉植物和雙子葉植物兩個分支，大麥HvPHO1;2和青稞HvnPHO1;2與山羊草AtsPHO1;2親緣關系最近(圖8)。

2.3 HvnPHO1;2亞細胞定位研究

將帶有載體pBI221- HvPHO1;2::GFP的農桿菌GV3101注射入煙草葉片中，對Hvn PHO1;2進行亞細胞定位研究發現綠色熒光信號分布于細胞膜上，說明HvnPHO1;2定位于細胞膜上(圖9)。

2.4 HvnPHO1;2表達模式分析

采用qPCR分析HvnPHO1;2的表達模式發現，在不同的器官中莖稈和籽粒中的表達量較高，其次是分蘗節和根(圖10-A)。低磷脅迫處理會明顯誘導青稞葉片和根中的HvnPHO1;2表達，葉片和根中HvnPHO1;2表達在第24 h后明顯增高，在低磷處理48 h之后葉片和根中的HvnPHO1;2的表達趨于穩定(圖10-B)。NaCl處理也能誘導青稞葉片和根中HvnPHO1;2的表達(圖10-C)。不同植物激素處理發現脫落酸ABA、茉莉甲酯MeJA能夠誘導青稞葉片中HvnPHO1;2的表達，而生長素NAA處理下青稞葉片中HvnPHO1;2的表達并沒有出現明顯變化(圖10-D～F)。

3 討 論

PHO1磷轉運體家族是植物體內多種磷轉運蛋白家族中的重要成員，PHO1家族在將吸收入植物體內的磷遠程轉運至地上部分的過程中發揮著重要的作用，其功能缺失后會導致植物體內磷向植株頂端轉運受到抑制，PHO1家族不僅存在于被子植物中，也廣泛分布于苔蘚、蕨類、裸子植物等其他高等植物中[15]。PHO1基因是從一個地上部分磷積累變少的擬南芥突變體中首次發現的，該突變體可以正常吸收磷進入根部，但磷通過維管束向芽轉移的過程受到抑制，正常供磷條件下根部對磷的吸收與野生型差異不大，在低磷培養條件下突變體嫩枝上的磷含量減少到野生型水平的3%～10%[16]。Rouached等[17]對擬南芥PHO1;2、PHO1;4基因功能缺失突變體pho1;2、pho1;4進行研究發現該擬南芥中磷元素無法被運轉到植株頂端，地上梢部葉片嚴重缺磷，但臨近根部的組織依然正常，將水稻OsPHO1;2轉入pho1;2、pho1;4突變體中發現擬南芥恢復了正常。蔣亭亭[18]對水稻OsPHO1功能缺失突變體ospho1進行研究發現ospho1對磷的吸收能力降低，磷由地下部分向上運輸能力受阻，ospho1生長緩慢，植株矮小，地上部表現缺磷癥狀，與野生型相比ospho1的株高、分蘗、穗長、結實率與千粒質量都明顯降低，但突變體種子長度增加，寬度降低。目前，關于植物磷酸轉運蛋白PHO1家族的研究主要集中在擬南芥和水稻等模式植物中，其他植物中的研究報道較少，尤其是青稞中尚未見研究報道。

本研究克隆了青稞磷轉運蛋白HvnPHO1;2基因和啟動子區域序列，對其基因和蛋白進行了生物信息學分析，并對其亞細胞定位和表達模式進行了研究。發現青稞HvnPHO1;2基因具有15個外顯子和14個內含子HvnPHO1;2為親水性不穩定蛋白，具有6個跨膜結構，不具有信號肽。啟動子元件分析發現HvnPHO1;2啟動子區域除了具有大量的TATA-box和CAAT-box啟動子核心元件以外還具有大量的植物激素相關順式作用元件，其中有6個脫落酸ABA和10個茉莉酸JA相關的順式作用元件，說明HvnPHO1;2受脫落酸和茉莉酸的調控。一些研究也表明PHO1家族中一些成員會受脫落酸和茉莉酸強烈誘導表達，尤其是脫落酸引起的氣孔關閉需要保衛細胞中特異表達PHO1，其具體原因和機制尚不清楚[19-20]。蛋白序列比對發現青稞HvnPHO1;2和大麥HvPHO1;2蛋白序列完全一致，并且都具有N端的SPX結構域和C端EXS的結構域，這兩個結構域是PHO1類蛋白的典型結構域。通過與其他物種的同源蛋白序列進行比對并構建系統進化樹發現青稞HvnPHO1;2和大麥HvPHO1;2與山羊草AtsPHO1;2親緣關系最近。本研究進行亞細胞定位發現HvnPHO1;2定位于細胞膜上。葉思誠[9]對不同磷水平下兩個油茶無性系根系轉錄組分析從中篩選并克隆了PHO1基因家族中的CoPHO1-3進行亞細胞定位預測分析發現很可能定位在細胞膜上。Ma等[14]對水稻OsPHO1;2進行亞細胞定位研究也發現OsPHO1;2定位于細胞膜上。有研究表明同一植物中PHO1基因家族不同成員的表達模式差異極大[21]。本研究對HvnPHO1;2的表達模式進行分析發現HvnPHO1;2在青稞莖稈和籽粒中表達量較高，并且受MeJA、ABA的誘導表達，這與其啟動子區域預測到有種子特異性調控和大量MeJA、ABA相關的順式作用元件結果一致，雖然其啟動子區域也預測到有1個生長素順式作用元件，但NAA處理并沒有誘導其表達。此外低磷和NaCl脅迫處理也可以明顯誘導HvnPHO1;2在青稞葉片和根中表達。崔維旭[22]克隆了森林草莓FvPHO1;H9并對其功能和表達模式進行研究發現FvPHO1;H9在花和葉柄中表達量高，而在幼葉、老葉、根中表達量低，在果實發育的過程中果實內FvPHO1;H9基因表達量不斷升高，低磷、干旱、低溫脅迫可以顯著誘導森林草莓根和葉中FvPHO1;H9表達，而赤霉素GA3和生長素IBA誘導效果不顯著，對FvPHO1;H9的RNAi干擾草莓株系進一步研究發現FvPHO1;H9表達量下降的株系長勢明顯不及野生型，根、葉片、果實中的磷含量積累明顯下降。何玲莉[23]克隆了大豆14個GmPHO1基因家族成員GmPHO1H01～GmPHO1H14，對其分子進化和功能分化進行研究發現，這些基因分布于7條染色體上，內含子數目為12～15個不等，GmPHO1H01～GmPHO1H08在營養和生殖器官中均有表達，GmPHOIH02在種子發育過程中其表達量較高，認為GmPHOIH02可能參與大豆種子發育過程，GmPHO1H09～GmPHO1H14主要在營養器官中表達，生殖器官中的表達量較低或不表達，其中GmPHO1H07受干旱和鹽脅迫誘導表達，GmPHO1H012和GmPHO1H014表達受干旱脅迫抑制，而鹽脅迫可以誘導其表達，認為GmPHO1H07、GmPHO1H012、GmPHO1H014可能參與調控應對脅迫反應。綜合上述研究結果，PHO1家族磷轉運蛋白在植物體內不僅僅參與磷元素的轉運，很可能具有其他的生理功能，本試驗克隆了青稞HvnPHO1;2基因和其啟動子區域序列并進行了初步研究，為青稞中磷高效吸收轉運相關基因研究提供了一定參考，關于其在青稞中的具體功能，有待于進一步研究。