牛miR-615潛在生物學功能分析及其組織表達鑒定

丁燕玲,王鵬飛,楊朝云,馬 應,師丹丹,史遠剛,康曉龍

(寧夏大學 農學院，銀川 750021)

miRNA是一類長度為18～22nt的單鏈非編碼小分子RNA，主要通過種子序列與靶基因的3’UTR區特定序列互補結合，抑制靶基因表達或誘導使其降解，進而調控機體的生物學過程[1-2]。miRNA的功能一般都是負調控，但近期研究表明，miRNA同樣也可以促進基因的表達[3-4]，這進一步拓寬了人們對miRNA調控方式的認知。肌肉的生長發育直接影響肉牛的產肉量和肉品質，肌細胞的增殖分化是肌肉組織正常發育的指標[5]，而miRNA是成肌細胞、骨骼肌衛星細胞增殖分化過程的重要調控因素[6-7]。研究發現，miR-1、miR-133和miR-206是3個在肌肉中特異性表達的miRNAs，miR-l、miR-206可以促進成肌細胞的分化，而miR-133則促進成肌細胞的增殖[8-10]。miR-378、miR-143能夠分別靶向POLA2和IGFBP5基因調節牛骨骼肌衛星細胞增殖和分化[11-12]；miR-133表達量的上調與巴什拜羊骨骼肌衛星細胞增殖分化狀態的轉換存在關聯性[13]；在小鼠骨骼肌組織中過表達miR-499，Tnni1基因表達量顯著上調，Tnni2基因表達顯著下調[14]；miR-127-3p通過直接靶向DDIT3基因/轉錄因子調控免疫與能量代謝類基因的表達，進而調節成肌細胞分化[15]。目前已鑒定出大量miRNAs通過調控相應靶基因和信號通路而影響骨骼肌衛星細胞和成肌細胞的增殖分化，然而miR-615對肌肉發育的研究少有報道。

miRNA靶基因的預測與鑒定是開展相關miRNA功能研究的基礎。前期研究基于轉錄組測序技術挖掘秦川牛剩余采食量(Residual feed intake, RFI)相關RNA分子時，發現miR-615是秦川牛RFI相關關鍵miRNAs之一，且在高RFI組中表達量上調[16]。由此，筆者推測miR-615及其靶基因可能通過影響飼料消化吸收參與調控牛能量代謝過程，進而調節肌肉的生長發育。因為肌肉組織是機體能量代謝及線粒體呼吸過程中的重要組織之一[17]，如轉基因小鼠內N-6多不飽和脂肪酸(N-6PUFA)轉化為N-3多不飽和脂肪酸(N-3PUFA)，顯著提高體內N-3PUFA含量，肌組織和細胞中N-3PUFA水平的增加促進了細胞內脂肪酸的氧化代謝和糖原合成，但是抑制了葡萄糖的有氧氧化和磷酸戊糖循環，同時線粒體內三羧酸循環和呼吸鏈復合體活性也顯著降低，進而抑制了氧化磷酸化生成ATP[18]。研究表明，miR-615是一種在真核哺乳動物中高度保守的miRNA，它不僅在胚胎發育過程中的成骨和血管形成中參與生長發育的調節，還參與調節細胞生長、分化和遷移，充當腫瘤抑制劑或腫瘤促進劑[19]。在大鼠軟骨分化誘導的骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)中，miR-615-3p過度表達后相關基因的mRNA表達顯著降低，促進軟骨形成的轉錄因子SOX9表達也顯著降低，從而抑制了大鼠的軟骨分化，而敲除miR-615-3p則得到相反的結果。這表明miR-615-3p抑制軟骨細胞特異性基因的表達，并可能抑制軟骨細胞分化[20]。在人類肝組織[21]、前列腺癌細胞[22]以及胰腺癌細胞[23]中，miR-615-5p通過抑制相應基因的表達或信號通路而抑制癌細胞增殖、遷移，但其在肌肉發育過程中的功能尚不明確。因此，為研究miR-615在牛肌肉發育過程中的潛在作用與功能，利用已有數據庫對牛miR-615的靶基因進行預測，并對其基因本體(Gene ontology,GO)和信號通路(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)進行富集分析；之后采用qRT-PCR法分析miR-615在牛主要機體組織中的表達模式，初步了解miR-615可能參與的生物學調控途徑及潛在功能，為進一步開展miR-615在牛肌肉發育過程中的調控機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 miR-615在不同物種間的保守性分析

從NCBI數據庫中檢索出牛miR-615的序列，并與人(Homosapiens, has)、獼猴(Macacamulatta, mml)、小鼠(Musmusculus, mmu)、馬(Equuscaballu, eca)、猩猩(Pongopygmaeus, ppy)、犬(Canisfamiliaris, cfa)等11個物種的miR-615序列進行比對，分析其在各物種間的保守性。

1.2 miR-615靶基因預測及功能富集分析

為了降低miR-615靶基因預測結果的假陽性，采用TargetScan、miRWalk和miRDB 3個在線軟件預測miR-615的靶基因，用軟件Veney繪制韋恩圖，得到3個數據庫預測結果的交集， 然后集合miRTarbase數據庫中經試驗驗證的靶基因組成下一步分析的基因集合；通過DAVID數據庫對預測到的miR-615靶基因集合進行GO、KEGG富集分析，以P<0.05為顯著性閾值。所用數據庫見表1。

表1 數據庫名稱及網址Table 1 Name database and website

1.3 miR-615在牛各組織中的表達量分析

1.3.1 試驗材料 選取寧夏某養殖場健康狀況良好、16月齡左右、體質量相近的3頭秦川公牛為試驗對象，屠宰后采集心、肝、脾、肺、腎等8個組織，帶回實驗室，置-80 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2 試驗試劑 根據天根生化科技(北京)有限公司RNA試劑盒說明書提取各組織RNA，分光光度計檢測RNA濃度和純度，檢測合格后備用。反轉試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)購自TakaRa公司，熒光定量試劑盒(ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3.3 總RNA提取及反轉錄 提取心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、背最長肌、皮下脂肪等8個組織的總RNA，按照反轉試劑盒進行cDNA合成，miRNA定量所需cDNA的反應總體系20 μL：第一步反應為5 g DNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，總RNA 2 μL，RNase Free ddH2O 5 μL， 42 ℃水浴2 min。第二步反應：上一步混合物 10 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，miR-615莖環引物1 μL，5xPrimeScript Buffer 2 4 μL，RNase Free ddH2O 4 μL。反應程序：50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；反應結束后，所得cDNA -20 ℃保存，備用。

1.3.4 miR-615組織表達分析 根據miR-615成熟體序列，設計上、下游及莖環引物，以18S為內參基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，詳細信息見表2。采用qRT-PCR法檢測 miR-615在心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、背最長肌、皮下脂肪等8個組織中的表達量。反應體系：2xChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，Primer F 0.8 μL，Primer R 0.8 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free ddH2O 6.4 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，56.5 ℃退火 30 s，共40個循環。每個樣品做3個重復，以2-ΔΔCT法計算相對表達量，數據用SAS 8.2軟件進行 分析。

表2 miR-615定量引物信息Table 2 miR-615 quantitative primer information

2 結果與分析

2.1 miR-615序列保守性分析

從NCBI數據庫中檢索出牛miR-615的序列，并與人、獼猴、小鼠、馬、猩猩、犬等11個物種的miR-615序列進行比對分析。結果表明(圖1)，不同物種之間的保守序列存在著一定差異，但Motif 1 在所涉及的物種間是共同的保守區域(圖1-A)，在對該區域進行功能富集分析發現(圖1-B)，該保守區域細胞定位于nucleus，主要參與蛋白質結合及轉錄等過程。牛miR-615保守區域2和3也主要富集到轉錄過程，表明miR-615的主要功能是參與遺傳物質的轉錄過程，這與miRNA集合到靶位點從而影響靶基因轉錄的功能相一致。

2.2 miR-615靶基因預測結果

利用TargetScan、miRWalk和miRDB軟件分別預測到2 903、14 254和288個miR-615的靶基因，取三者的交集，獲得108個共有靶基因，其中miRTarbase數據庫中經試驗驗證的靶基因有35個，合并后共得到139個基因集合用于后續功能富集分析(圖2，表3)。

表3 miR-615的靶基因統計Table 3 Statistics of miR-615 target genes

2.3 miR-615靶基因集合的GO分析

針對139個靶基因進行GO分析，結果發現共有29個GO條目，其中15個GO條目屬于生物學過程(Biological process，BP)，靶基因富集程度最高的GO條目有RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄調控、基因表達的正調控及鈣離子調節的神經遞質胞吐等；4個GO條目分布在細胞組分(Cell components，CC)，其中在細胞內膜和細胞質富集的基因最多；10個GO條目為分子功能(Molecular function，MF)，靶基因顯著富集在RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子與DNA的特異性結合、GTP酶激活劑的活性、組蛋白去甲基酶活性(H3-K27特異性)等條目中(P<0.05)(表4)。

表4 miR-615潛在靶基因的GO注釋Table 4 GO annotations of miR-615 predicted target genes

2.4 miR-615靶基因集合的KEGG分析

經KEGG富集通路分析，miR-615的靶基因顯著富集于PI3K-AKT和MAPK信號通路 (P<0.05)(表5)，以上通路在肌肉生長發育、脂肪沉積、能量代謝過程中發揮重要的調控作用。其他富集通路盡管未達到顯著性水平，但也多與肌肉發育及能量代謝等過程密切關聯，如STIM1是定位于細胞內質網上的蛋白，它的主要功能是介導受體依賴型的鈣離子內流，而鈣離子作為第二信使能直接與Ras-GTP結合并顯著增加Ras信號通路的活性[24]。研究發現STIM1的表達可促進成骨細胞的增殖，從而增加成骨細胞的數量，在MC3T3-E1細胞沉默STIM1的表達后，明顯抑制鈣離子依賴的Ras信號通路的活性 (P<0.05)，成骨細胞會出現增殖抑制現象[25]。

表5 miR-615潛在靶基因KEGG通路富集分析Table 5 KEGG pathway enrichment analysis of target gene predicted by miR-615

2.5 牛miR-615的組織表達鑒定

采用莖環熒光定量PCR方法檢測牛各組織中miR-615的表達，由圖3可知，miR-615在皮下脂肪中的表達量最高，其次是背最長肌；miR-615在背最長肌和心臟組織中的表達差異不顯著 (P>0.05)，但在皮下脂肪中的表達量顯著高于背最長肌和心臟組織(P<0.05)。在其他組織中miR-615均呈現低表達模式，且各組織間表達差異不顯著(P>0.05)。上述結果提示，牛miR-615可能通過機體脂肪代謝及肌肉活動過程發揮重要生物學功能，但詳細機制需進一步的試驗進行佐證。

3 討 論

胰島素樣生長因子2(Insulin-like growth factor 2，IGF2)是一種胎兒生長分化因子，在肌肉生長和成肌細胞增殖分化中起重要作用[26]，高表達IGF2時，可以促進肌肉的形成，而當IGF2基因被抑制時，則阻礙肌肉生成[27]。IGF2基因是miR-615的預測靶基因，大量研究證明IGF2基因在肌肉生長發育中起著極其重要的作用，它可以與肌肉發育相關的轉錄因子作用從而調控其過程[28]。牛IGF2基因定位于 29 號染色體，由 10 個外顯子組成，該染色體包含牛的產肉、產奶和健康性狀的數量性狀位點[29-30]。研究發現秦川牛IGF2基因內含子3序列中 3 106 bp 位置附近的序列是轉錄因子ZBED6在牛基因組上的結合位點，干擾ZBED6后，對IGF2基因的表達具有明顯抑制作用，從而阻礙了肌肉的生成；而過表達后則促進IGF2基因表達，并加快肌肉的生長發育[31]。本試驗所得結果中IGF2是miR-615 的靶基因之一，牛 miR-615是否通過IGF2基因調控肌肉的生長發育目前仍不明確，IGF2 也將是后續開展試驗驗證的關鍵候選靶基因之一。

對 miR-615 靶基因集合進行 KEGG 富集分析，發現靶基因集顯著富集于PI3K-AKT信號通路，該通路是細胞周期過程中非常重要的細胞內信號傳導途徑，其通過影響下游分子的活化狀態維持細胞的凋亡和增殖[32]。PI3K是脂質激酶家族成員，通過磷脂酰肌醇(PI)的特異性催化3-羥基磷酸化[33]；AKT是絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K途徑的中心介質，在許多細胞過程中起關鍵作用，包括葡萄糖代謝，細胞凋亡、增殖和遷移[34]。蘇氨酸磷酸化位點(Thr308)和絲氨酸磷酸化位點(Ser473)發生磷酸化后激活AKT蛋白，激活后的AKT直接磷酸化其底物雷帕霉素靶體蛋白(mTOR)，從而使其被激活。大量研究表明，PI3K-AKT-mTOR信號通路對骨骼肌的生長、存活和分化至關重要[35]。葡萄糖調節內質網伴侶蛋白94(GRP94)對早期胚胎發育至關重要，上調GRP94可使PI3K-AKT-mTOR信號通路中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平降低，從而抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路，但可使C2C12細胞中轉錄因子MyoG的表達水平升高，表明GRP94可通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路而促進肌肉分化[36]。此外，MSCs是骨髓中存在的一類具有強大增殖能力和多向分化潛能的非造血干細胞，能定向分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞等，在MSCs成骨誘導分化過程中，加入PI3K特異性抑制劑LY294002后，明顯抑制AKT的磷酸化，從而抑制MSCs的生長，提示PI3K-AKT信號通路在MSCs成骨誘導分化中起正調節作用[37]。但miR-615是否通過靶向GRP94基因來調節PI3K-AKT-mTOR信號通路，并調控牛肌細胞的增殖分化有待進一步驗證。

MAPK信號通路是本試驗通過KEGG分析發現的靶基因顯著富集的通路(P<0.05)，該通路由細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)、c-Jun N-末端激酶(JNK)和p38絲裂原激活蛋白激酶(p38-MAPK)3 個家族成員組成，這些通路是肌肉發育、脂肪生成的主要細胞內信號通路之一[38]，該通路可能受一些上游因素的影響，或者影響下游因素，或直接影響脂肪因子、脂肪細胞分化基因的表達[39]。參與MAPK信號傳導的基因主要包括MAP3K5、MAP2K3和MAP2K2[40]。研究發現MAP3K5基因對畜禽RFI性狀具有重要的調控作用，該基因不僅是生長及采食特征相關的候選基因，同時也與胚胎發育、肌肉發生、脂肪形成以及細胞免疫等密切關聯[41]，當敲除或突變MAP3K5基因后，H2O2誘導的JNK活性受到抑制，進而抑制c-JNK N末端激酶和p38-MAPK激酶觸發凋亡激酶級聯反應，使得宿主細胞的分化凋亡、胃排空速率及食物利用效率顯著下降[42]，即脂肪代謝效率下降，脂肪在機體內儲存，最終導致人和家畜肥胖；而肌肉中脂肪的含量與肉的風味、嫩度和多汁性存在密切聯系，因此MAPK信號通路(尤其MAP3K5基因)可能在牛肌肉生長發育過程中發揮重要作用。MSCs是一種自我更新和分化的干細胞，骨形態發生蛋白2(BMP-2)或骨形態發生蛋白4(BMP-4)誘導的MSCs具有顯著的成骨傾向[43-44]，是骨折愈合過程中的關鍵細胞之一。有研究發現，負壓傷口治療(NPWT)通過MAPK途徑促進MSCs的增殖和成骨分化，當ERK、P38和JNK通路受到抑制時，成骨細胞相關基因和蛋白的表達降低，細胞的增殖能力下降，從而NPWT受到抑制[45]；p38通路的抑制降低了BMP4誘導的MSCs的成骨能力，而在多能干細胞C2C12成肌細胞系中，BMP-2可激活ERK和p38[46]。過度運動會導致氧化應激引起肌肉的炎癥反應，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是一種抗炎分子，PPARγ通過抑制分化的C2C12細胞中ERK、p38-MAPK信號通路和核轉錄因子-κB(NF-κB)從胞漿向細胞核轉運，顯示出抗炎和抗氧化雙重作用，從而保護肌肉纖維[47]。由此推測miR-615可能通過靶向MAPK通路中MAP3K5、PPARγ等基因影響肌肉發育。

4 結 論

本文對牛miR-615靶基因及生物學功能進行預測分析，并鑒定miR-615在牛主要組織中的表達模式。結果表明miR-615可能通過潛在靶基因IGF2、GRP94和PPARγ等直接或間接參與肌肉發育相關的MAPK和PI3K-AKT信號通路，進而調控牛成肌細胞增殖和分化，但這一推斷仍需后續的試驗驗證。