紅細胞分布寬度、miR-130a與乙型肝炎肝硬化并發消化道出血及病情進展的關聯性*

孫喜斌，張玉虹，左路廣，賈 倩，連晶晶，馮 博，高詠梅，張 斌

河北北方學院附屬第一醫院檢驗科，河北張家口 075000

肝硬化是慢性乙型肝炎(下稱乙肝)患者發展的終末階段，而消化道出血(GB)則是乙肝肝硬化最兇險的并發癥之一，具有起病急驟、復發率高、預后不良等特點，若未予以及時有效地干預，短期內大量出血會引發失血性休克，嚴重者甚至死亡[1-3]。目前臨床尚未完全明確乙肝肝硬化并發GB的病理機制，有相關研究認為[4-5]，肝臟是造血的主要器官，以生成紅細胞為主，肝硬化后，肝臟正常結構發生改變，可能導致紅細胞系統異常，從而引發不同程度的貧血現象。紅細胞分布寬度(RDW)是評價外周血紅細胞體積異質性的定量指標[6]。另外，有研究表明[7]，微小RNA(miRNA)作為調控基因表達的重要因子，可能參與肝硬化并發上消化道出血的發生、發展。miR-130a屬miRNA的一種，具有抗病毒、抗感染等作用，高飛等[8]研究認為，其可作為評估乙肝病毒相關肝臟衰竭的病情程度以及預后中提供數據支持，但關于其與RDW聯合對乙肝肝硬化并發GB的診斷價值臨床鮮少報道。因此，本研究嘗試分析RDW、miR-130a與乙肝肝硬化并發GB及其病情進展的關聯性。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年9月本院204例乙肝肝硬化患者，根據有無GB分為GB組(n=71)與非GB組(n=133)。其中GB組女50例，男21例，年齡47～73歲，平均(58.74±5.20)歲；Child-Pugh分級：10例A級，18例B級，43例C級；非GB組：女101例，男32例，年齡48～75歲，平均(59.05±4.68)歲；Child-Pugh分級：20例A級，32例B級，81例C級。兩組基本資料(年齡、性別、Child-Pugh分級)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。具有可比性。

納入標準：(1)GB組伴有嘔血和(或)黑便等臨床表現，并經胃鏡檢查證實；(2)兩組均符合乙肝肝硬化相關標準[9]。排除標準：(1)合并原發性血液系統疾病者；(2)近期有食管曲張靜脈套扎或門體分流及其他治療者；(3)近12周內有抑酸類藥物、抗菌藥物或非甾體消炎藥等服用史者；(4)合并肝癌或其他惡性腫瘤者；(5)合并心腦等其他重要臟器器質性損害者；(6)精神行為失常者。本研究經過本院倫理委員會經審核評議通過，所有研究對象均知情，并簽訂同意書。

1.2方法 (1)空腹取8 mL靜脈血，通過XS-500i全自動細胞分析儀測定RDW，嚴格按照日本美康公司提供的儀器說明書操作；1 000×g離心12 min(離心半徑10 cm)，分離取血清，置于-20 ℃低溫保存。(2)肝功能指標：采用BS-480全自動生化分析儀測定天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、γ-谷氨酰轉肽酶(GGT)，嚴格按照深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司提供的儀器說明書操作。(3)miR-130a表達：利用美國Ambion公司提供的mirVana miRNA分離試劑盒提取血清總RNA，使用美國Thermo Scientific公司提供的Nanodrop 2000分光光度計檢測RNA純度。根據GenBank數據獲取待測基因序列，并按照實時熒光定量PCR引物設計原則以Primer 5.0軟件設計引物，以β-actin為內參基因，上游引物為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；miR-130a上游引物：5′-AGT CTA TAC AAG GGC AAG CTC TC-3′；下游引物：5′-CCC AAT ACG ACC AAA TCC GTT-3′。反應體系：上、下游引物各0.4 μL、超級酶混合物0.2 μL、去RNA水3.4 μL、RNA模板0.6 μL、RT-qPCR緩沖液5 μL。擴增體系：93 ℃預變性5 min；93 ℃ 40 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共40個循環。血清miR-130a相對表達量以2-ΔΔCt計算。

1.3乙肝肝硬化并發GB病情程度評估標準[10]頭暈，失血量<500 mL，收縮壓(SBP)基本正常、心率(HR)正常，血紅蛋白(Hb)未改變，休克指數(HR/SBP)=0.5為輕度；暈厥、口渴、少尿，500 mL≤失血量≤1 000 mL，SBP降低，HR>100 次/min，70 g/L≤Hb≤100 g/L，0.5<休克指數≤1.0為中度；失血量>1 000 mL，SBP<80 mm Hg，HR>120次/min，Hb<70 g/L，肢冷、少尿、意識模糊，休克指數>1.0為重度。

1.4觀察指標 (1)比較兩組肝功能指標(AST、ALT、GGT)、RDW、miR-130a表達。(2)分析肝功能指標與RDW、miR-130a表達相關性。(3)分析RDW、miR-130a單一及聯合對乙肝肝硬化并發GB的診斷效能。(4)比較GB組不同病情程度患者的臨床資料，包括性別、年齡、Child-Pugh分級、脾臟厚度、腹水、胃左靜脈內徑、門靜脈內徑及食管靜脈曲張，其中脾臟厚度、腹水、胃左靜脈內徑、門靜脈內徑均采用彩色多普勒超聲診斷儀(購自美康電子設備有限公司)測定；食管靜脈曲張予以胃鏡觀察。(5)比較GB組不同病情程度患者肝功能指標(AST、ALT、GGT)、RDW、miR-130a表達。(6)分析乙肝肝硬化并發GB病情的影響因素。

2 結 果

2.1兩組肝功能指標、RDW、miR-130a表達 GB組AST、ALT、GGT、RDW水平均高于非GB組，miR-130a相對表達水平低于非GB組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組肝功能指標、RDW、miR-130a表達對比

2.2肝功能指標與RDW、miR-130a表達相關性 GB組RDW與AST、ALT、GGT呈正相關關系(r=0.701、0.673、0.558，P<0.05)，miR-130a表達與AST、ALT、GGT呈負相關關系(r=-0.730、-0.666、-0.629，P<0.05)。見圖1～6。

圖1 RDW與肝功能指標AST相關性

2.3RDW、miR-130a表達對乙肝肝硬化并發GB的診斷效能 ROC曲線顯示，RDW、miR-130a表達聯合診斷乙肝肝硬化并發GB的AUC最大，為0.771，靈敏度、特異度分別為77.46%、68.42%。見表2，圖7。

圖7 ROC曲線

表2 RDW、miR-130a表達對乙肝肝硬化并發GB的診斷效能

圖2 miR-130a表達與肝功能指標AST相關性

2.4GB組不同病情程度患者臨床資料 GB組不同病情程度患者年齡、Child-Pugh分級、脾臟厚度、腹水、胃左靜脈內徑、門靜脈內徑及食管靜脈曲張情況相比，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

圖3 RDW與肝功能指標ALT相關性

圖4 miR-130a表達與肝功能指標ALT相關性

圖5 RDW與肝功能指標GGT相關性

2.5GB組不同病情程度患者肝功能指標、RDW、miR-130a表達 GB組不同病情程度患者肝功能指標AST、ALT、GGT、RDW、miR-130a相比，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 GB組不同病情程度患者臨床資料對比[n(%)]

表4 GB組不同病情程度患者肝功能指標、RDW、miR-130a表達對比

圖6 miR-130a表達與肝功能指標GGT相關性

2.6乙肝肝硬化并發GB病情的影響因素 以乙肝肝硬化并發GB病情為因變量(賦值：輕度=1，中度=2，重度=3)，將表3、4中有差異因素納入Logistic回歸分析，結果顯示，Child-Pugh分級、脾臟厚度、腹水、胃左靜脈內徑、門靜脈內徑及食管靜脈曲張、RDW、miR-130a均為乙肝肝硬化并發GB病情的影響因素(P<0.05)。見表5。

表5 乙肝肝硬化并發GB病情影響因素

3 討 論

有研究報道[11]，肝硬化并發GB患者病死率可達15.00%～29.00%。因此，及早明確乙肝肝硬化并發GB病情程度，予以有效治療措施，對預后改善至關重要。

RDW是紅細胞體積檢測主要參數之一，與紅細胞玻片鏡檢本比較，在診斷缺鐵性貧血方面更具客觀性與準確性[12-13]。本研究經全自動細胞分析儀檢測可知，RDW表達在乙肝肝硬化并發GB患者中過度上調，并與AST、ALT、GGT存在正相關關系。結合李海深等[14]、宋怡然等[15]研究考慮這可能歸因于一方面，乙肝肝硬化時，肝臟解毒功能損傷，不僅會加重肝損傷程度，分泌大量炎癥細胞，激活炎癥級聯反應，影響紅細胞生長發育，還會引起門靜脈高壓，誘導脾功能亢進，破壞紅細胞正常功能，縮短紅細胞壽命，從而上調RDW；另一方面，肝硬化消化道出血所致急性或慢性失血，會引發失血性貧血，降低鐵水平，主要表現為小細胞低色素貧血。由此推測，RDW可能在乙肝肝硬化并發GB發生、發展中起著重要作用。RDW有望成為乙肝肝硬化并發GB診斷的潛在指標，有助于指導臨床診治。另外，秦嬌等[16]經多變量分析發現，RDW是乙型肝炎病毒相關慢性與急性肝衰竭患者短期死亡的獨立危險因素。LOU等[17]認為，RDW在各類乙肝患者中均顯著升高，并與疾病嚴重性存在正相關性。本研究通過多因素Logistic回歸分析顯示，RDW高水平是乙肝肝硬化并發GB病情程度的獨立危險因素，與孫喜斌等[18]研究存在相似性，說明RDW可反映乙肝肝硬化并發GB病情程度。

miR-130a屬miR-130家族之一，近年來有報道指出[19]，其不僅能控制淋巴細胞定向轉移，調節淋巴細胞趨化性，刺激中性粒細胞、上皮細胞趨化因子受體表達，還能在PI3K/Akt/PTEN/mTOR等耐藥信號轉導途徑中起中介作用。本研究經分組對比研究提示，miR-130a在乙肝肝硬化并發GB患者中呈低表達，并隨病情程度加重出現下降趨勢，與霍續磊等[20]研究結果不一致，可能與二者研究對象不同有關。上述結果產生機制可能為乙肝肝硬化并發GB患者病理性免疫反應激活，可造成miRNA-130a下降，促使淋巴細胞錨定融合血管內壁，誘導免疫細胞束縛病變靶細胞，釋放白細胞介素1、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子，最終形成惡性循環。另外，LI等[21]經小鼠模型證明，miR-130a可活化α平滑肌肌動蛋白，誘導內皮向間充質轉化，繼而在多種病因所致肝損傷或肝衰竭發病過程中發揮重要作用。本研究經Pearson線性相關性分析發現，miR-130a表達與AST、ALT、GGT存在負相關性。表明miR-130a表達下調可能加重肝功能損傷，主要與免疫炎性反應加劇有關，但具體機制有待今后深入分析。然而miR-130a單一診斷乙肝肝硬化并發GB存在一定局限性，故本研究采取聯合診斷模式，結果顯示，RDW、miR-130a聯合診斷乙肝肝硬化并發GB的AUC高于上述指標單一診斷，為0.771。進一步證明了RDW、miR-130a聯合在乙肝肝硬化并發GB中的診斷價值。此外，陳煬森[22]研究指出，Child-Pugh分級為C級、食管胃底靜脈曲張是肝硬化并上消化出血死亡的獨立危險因素；王柳青等[23]認為，胃左靜脈內徑、食管胃底靜脈曲張是肝硬化并發首次上消化道出血致命的獨立危險因素，與本研究觀點具有相似性。故評估乙肝肝硬化并發GB病情程度的同時應將Child-Pugh分級、脾臟厚度、腹水、胃左靜脈內徑、門靜脈內徑、食管靜脈曲張等因素納入考慮范圍內，以減少數據偏移。

綜上所述，RDW、miR-130a與乙肝肝硬化并發GB患者肝功能存在良好線性關系，也是乙肝肝硬化并發GB病情的重要影響因素，二者聯合檢測可為臨床診斷乙肝肝硬化并發GB、評估病情程度、開展個性化治療提供一種新途徑。