江門市新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏篩查方法的切值分析及基因突變發(fā)生情況

楊應(yīng)松 鐘志來(lái) 楊 梅 譚杰亮 劉穎妍 曾欽龍 李智明 唐 佳

廣東省江門市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東江門 529000

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥（glucose-6-phos phate dehydrogenase deficiency，G6PDd），又稱為“蠶豆病”，是我國(guó)廣東、廣西、海南等沿海省份高發(fā)的病種之一[1]。G6PDd 患兒在服用蠶豆后就會(huì)出現(xiàn)核黃疸及急性溶血癥狀，嚴(yán)重威脅患兒性命。G6PDd 目前沒(méi)有有效的根治措施，以預(yù)防及對(duì)癥治療為主。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）建議，在男性G6PDd 發(fā)病率超過(guò)3%～5%的高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)應(yīng)常規(guī)開(kāi)展新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氧酶（glucose-6-phosphate，G6PD）的篩查[2]。通過(guò)對(duì)患兒進(jìn)行最有效的早篩查、早診斷、早干預(yù)，從而避免溶血、核黃疸等不良后果的發(fā)生[3]。熒光定量法是G6PD 篩查的常用方法，但目前G6PD 的篩查切值目前尚沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。章曉燕等[4]在2015年調(diào)查我國(guó)220 家篩查實(shí)驗(yàn)室，結(jié)果顯示G6PD 切值分布在2.00～10.00 U/g Hb，且不同實(shí)驗(yàn)室來(lái)源的樣本，其診斷的切值也存在一定的差別。本研究對(duì)江門市新生兒遺傳代謝病篩查中心的G6PD 篩查情況、召回情況進(jìn)行回顧性分析，旨在了解江門市新生兒的G6PD 突變基因型，并通過(guò)回顧分析制定適合的切值，以期提高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月至2020年5月在江門市新生兒遺傳代謝病篩查中心進(jìn)行G6PD 篩查的113 665 例新生兒血斑者作為研究對(duì)象進(jìn)行回顧性分析，其中男59 651 例，女54 014 例，男女比例為1.1∶1。所有參與篩查的新生兒家屬或監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書，并自愿參與本研究。本研究已經(jīng)相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①出生滿72 h 者；②充分哺乳8 次以上者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①哺乳不足者；②臨床資料不全，無(wú)法召回者。

1.2 方法

1.2.1 G6PD 熒光定量法 在新生兒監(jiān)護(hù)人知情同意下，新生兒在生后48 h 并充分哺乳8 次以上后，由專科護(hù)士采集足跟血制成干血斑。血斑通過(guò)快遞送至江門市新生兒遺傳代謝病篩查中心檢測(cè)。使用廣州豐華生物工程有限公司G6PD 熒光定量分析試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書操作。對(duì)G6PD≤3.0 U/g Hb 判定為陽(yáng)性，并均對(duì)該范圍內(nèi)的新生兒進(jìn)行召回，召回成功的疑似G6PDd 新生兒有889 例。同時(shí)隨機(jī)選取初篩G6PD 陰性的2839 例新生兒進(jìn)行追蹤隨訪，采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析G6PD 熒光定量法篩查的切值。

1.2.2 G6PD 酶活性檢測(cè) 將889 例召回的可疑G6PDd新生兒進(jìn)行進(jìn)一步分析。采集召回的可疑G6PDd 患兒靜脈血，采用G6PD 定量測(cè)定試劑盒速率法（北京利德曼生物有限公司）及TBA-2000FR 全自動(dòng)生化分析儀（日本東芝）測(cè)定酶活性，以酶活性＜1300 U/L 者診斷為陽(yáng)性。

1.2.3 G6PD 熱點(diǎn)基因變異檢測(cè) 采用多色熔解曲線G6PD 基因突變檢測(cè)試劑盒（廈門致善生物科技公司）及SLAN96P 熒光定量PCR 儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司），對(duì)國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的12 種突變位點(diǎn)（c.95A＞G、c.383T＞C、c.392G＞T、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A）進(jìn)行定性測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

統(tǒng)計(jì)113 665 例新生兒的G6PD 熒光定量法篩查結(jié)果，并進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)889 例召回的可疑G6PDd 新生兒的熱點(diǎn)基因變異檢測(cè)及酶活性確診結(jié)果，分析G6PD 熒光定量法的切值。其中G6PD 熒光定量法篩查陽(yáng)性和召回的標(biāo)準(zhǔn)均為G6PD≤3.0 U/g Hb。酶活性檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)為＜1300 U/L，正常范圍為≥1300 U/L。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示。G6PD 熒光定量法診斷切值用ROC 進(jìn)行分析確定，根據(jù)ROC 曲線下面積（area under the curve，AUC）的最大確定最終的切值。

2 結(jié)果

2.1 G6PD 熒光定量法篩查情況

對(duì)113 665 例新生兒G6PD 熒光定量法篩查結(jié)果進(jìn)行分析，以≤3.0 U/g Hb 為切值，對(duì)所有G6PD 熒光定量法篩查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，共篩查出可疑陽(yáng)性男嬰4180 例，女嬰814 例，男女比例為5.14∶1。男女初篩陽(yáng)性率分別為7.01%、1.51%，總體篩查陽(yáng)性率達(dá)4.39%。

表1 江門市G6PD 熒光定量法篩查陽(yáng)性患者的性別分布

男、女嬰的G6PD 熒光定量法篩查分布結(jié)果見(jiàn)圖1、2，結(jié)果顯示，男嬰篩查結(jié)果呈雙峰分布，女嬰篩查結(jié)果大致呈正態(tài)分布，分別在2.9～3.2 U/g Hb 及1.8～2.0 U/g Hb 存在波谷。

圖1 113 665 例新生兒中男、女嬰的G6PD 熒光定量法篩查結(jié)果分布圖

2.2 召回疑似G6PDd 新生兒的熱點(diǎn)基因變異檢測(cè)及酶活性確診結(jié)果

召回的889 例疑似G6PDd 新生兒中，有222 例進(jìn)行了熱點(diǎn)基因突變檢測(cè)，共檢測(cè)出220 例發(fā)生突變。男嬰188 例半合子突變，突變類型以c.1388G>A（占比33.51%）、c.1376G>T（占比30.32%）、c.95A>G（占比14.36%）、c.871G>A（占比9.57%）、c.1024C>T（占比6.91%）的檢測(cè)率較高，占男嬰突變位點(diǎn)的94.68%（表2）；女嬰雜合突變20 例，復(fù)合雜合10 例，純合1例，雙重雜合1 例（表3）。

表2 220 例發(fā)生突變新生兒中男嬰的熱點(diǎn)基因變異類型檢測(cè)結(jié)果

表3 220 例發(fā)生突變新生兒中女嬰的熱點(diǎn)基因變異類型檢測(cè)結(jié)果

召回的889 例疑似G6PDd 新生兒中，有835 例進(jìn)行酶活性確診，男嬰724 例，確診陽(yáng)性715 例，女嬰111 例，確診陽(yáng)性86 例。召回的889 例疑似G6PDd 新生兒中，同時(shí)進(jìn)行熱點(diǎn)基因突變檢測(cè)及酶活性確診的有179 例，其中有7 例酶活性在正常范圍內(nèi)，均為女性，即有7 例女嬰的酶活性結(jié)果與G6PD 熒光定量法篩查方法結(jié)果不一致。后經(jīng)熱點(diǎn)基因突變檢測(cè)，均確診為雜合突變。

2.3 G6PD 熒光定量法篩查切值的ROC 曲線分析

針對(duì)召回的889 例疑似G6PDd 新生兒以及隨機(jī)選取初篩G6PD 陰性的2839 例新生兒進(jìn)行追蹤隨訪，采用ROC 分析G6PD 熒光定量法篩查的切值。隨訪共得到假陽(yáng)性43 例，假陰性12 例。

按性別的不同對(duì)G6PD 熒光定量法進(jìn)行ROC 曲線分析，AUC 最大值作為該篩查方法的最佳切值，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，男、女嬰的AUC 最大值分別是0.992 和0.888，其所對(duì)應(yīng)的男嬰和女嬰G6PD 水平的切值分別為2.98、2.97 U/g Hb（表4）。

表4 G6PD 熒光定量法篩查切值的ROC 曲線分析

圖2 男嬰、女嬰G6PD 熒光定量法篩查切值的ROC 曲線分析

3 討論

G6PD 基因突變時(shí)，機(jī)體紅細(xì)胞膜上的G6PD 酶數(shù)量減少或活性降低，導(dǎo)致還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）生成減少，不能維持紅細(xì)胞的柔韌性，紅細(xì)胞不易通過(guò)脾竇或肝竇而被破壞，容易導(dǎo)致新生兒高膽紅素血癥甚至核黃疸[5-6]。有研究報(bào)道[7]顯示，16.4%的G6PDd 患兒因高膽紅素血癥需要輸血治療，幾乎是非G6PDd 新生兒的5 倍。G6PDd 目前沒(méi)有根治的治療手段，及早確診、健康教育、預(yù)防發(fā)病是目前最重要的預(yù)防措施。G6PD 缺乏癥在我國(guó)的發(fā)病率呈南高北低的趨勢(shì)，廣東省是G6PDd 的高發(fā)區(qū)，發(fā)病率可達(dá)3.1%～16.1%[8-9]。因此，將G6PDd 列入新生兒疾病篩查，有助于預(yù)防G6PDd 導(dǎo)致的新生兒高膽紅素腦病及嚴(yán)重溶血性貧血，因此早期確診、健康教育，對(duì)避免新生兒觸及致病因素等顯得尤為重要。

江門市篩查中心自2005年起，開(kāi)始推廣G6PDd篩查，2018年將G6PDd 篩查納入新生兒遺傳代謝病篩查補(bǔ)助項(xiàng)目，對(duì)江門市新生兒進(jìn)行普篩。本研究選取2018年1月至2020年5月在江門市新生兒遺傳代謝病篩查中心進(jìn)行篩查的113 665 例新生兒血斑者作為研究對(duì)象進(jìn)行回顧性分析，以確診方法評(píng)估目前的篩查手段，制定合適的切值，以提高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。江門市的男、女嬰初篩陽(yáng)性率分別為7.01%、1.51%，總體篩查陽(yáng)性率達(dá)4.39%，整體處于中等水平，這與相關(guān)報(bào)道[10]的結(jié)果大致相符。

目前G6PDd 的診斷性方法主要有G6PD 酶活性檢測(cè)和基因突變檢測(cè)。在本研究中熱點(diǎn)基因檢測(cè)結(jié)果顯示，男嬰188 例半合子突變，突變類型以c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G、c.871G>A、c.1024C>T、c.392G>T 較為多見(jiàn)，其中以c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G三者的檢出率較高，而前兩者也是中國(guó)人特有的與G6PD 活性相關(guān)的基因突變位點(diǎn)，驗(yàn)證了既往相關(guān)研究者們[11-12]的研究結(jié)論。酶活性檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速且成本低，容易在各醫(yī)療單位開(kāi)展。本研究中篩查陽(yáng)性與酶活性檢測(cè)，男嬰、女嬰符合率分別為98.76%、77.48%。根據(jù)隨機(jī)失活學(xué)說(shuō)，女性雜合子由于其X 染色體隨機(jī)失活，導(dǎo)致部分女性雜合子酶活性可在正常范圍內(nèi)，故呈現(xiàn)出X 連鎖半顯性遺傳[13]。因此單以酶活性作為診斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，男嬰的符合率高，女嬰的符合率偏低[14]。對(duì)女性雜合子、臨床高度懷疑而酶活性正常者，基因檢測(cè)是確診的重要依據(jù)，本研究中，有7 例女嬰的酶活性結(jié)果與G6PD 熒光定量法篩查方法結(jié)果不一致，后經(jīng)熱點(diǎn)基因突變檢測(cè)，均確診為雜合突變，因此對(duì)于女性雜合突變者，單以酶活性作為確診依據(jù)，有可能會(huì)造成漏診，建議有條件的單位應(yīng)開(kāi)展G6PD 基因檢測(cè)更佳。

各地篩查中心的切值來(lái)源主要是試劑盒說(shuō)明書、篩查共識(shí)，但由于各地的發(fā)病率不同，因此篩查中心需不斷積累各自實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)，制定本地區(qū)、本實(shí)驗(yàn)室的切值，以降低假陽(yáng)性，防止假陰性的發(fā)生[15]。如果單純通過(guò)百分位數(shù)法來(lái)制定切值，難以確定百分位數(shù)的范圍。ROC 曲線能把篩查方法切值的靈敏度和特異度平衡在一個(gè)最佳點(diǎn)，對(duì)追蹤隨訪的3728 例新生兒進(jìn)行ROC 曲線分析，男嬰和女嬰AUC 分別為0.992 和0.888，其所對(duì)應(yīng)的男嬰和女嬰G6PD 水平的切值分別為2.98、2.97 U/g Hb，因此筆者建議，將G6PD 熒光定量法切值設(shè)為3.0 U/g Hb 是比較符合的。不過(guò)在張鈺等[16]的研究中，四川新生兒G6PD 熒光定量法的篩查切值在3.4 U/g Hb，與本研究結(jié)果之間存在一定的差異。分析原因，可能是由于地區(qū)不同，也可能是由于本研究的樣本量數(shù)據(jù)不夠大，因此結(jié)果有所偏差。因此各地篩查中心在今后的工作中需要不斷積累數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的回顧性分析，以便得到更切合各地區(qū)實(shí)際的切值，從而盡可能地降低假陽(yáng)性率。

綜上所述，江門市新生兒G6PD 基因突變的發(fā)生情況處于中等水平，其中以c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G、c.871G>A、c.1024C>T、c.392G>T、c.1360C>T、c.1004C>A 為主要突變位點(diǎn)。建議以3.0 U/g Hb 作為江門市G6PD 熒光定量法篩查的切值，是較為符合的，有助于減少假陽(yáng)性率。