促紅細胞生成素及其衍生物對神經保護作用的研究進展

胡明沛 王丹丹 徐明波 楊仲璠 曹榮月

1.中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇南京 210009；2.北京雙鷺藥業股份有限公司北京市重組蛋白及其長效制劑工程技術研究中心，北京 100143

促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種糖蛋白激素，受缺氧誘導，其主要作用是抑制骨髓中紅系祖細胞的凋亡并促進其增殖、分化和成熟，臨床上多用于治療腎性貧血及腫瘤、早產等相關性貧血。近些年來，已在多種組織系統中觀察到EPO 具有抑制細胞凋亡、減輕炎癥反應、抵抗氧化應激及促進血管生成等保護作用，特別是神經系統[1]。然而EPO 用作神經保護劑時給藥劑量較高，容易激發其造血活性，增加了高血壓及血栓形成等風險[2]。規避該副作用的主要方法是使用非促紅EPO 衍生物[3]，不同形式的EPO 衍生物作用機制有所不同，但均顯示出抗氧化、抗凋亡與抗炎特性，已有越來越多的研究在動物及臨床試驗中證實了EPO 及其衍生物在治療神經退行性疾病中的重要作用。

1 EPO 與EPOR

人EPO 基因定位于7 號染色體長臂中段，由5個外顯子和4 個內含子組成。體內存在的活性EPO 分子含有165 個氨基酸，相對分子量為30.4 kD。EPO 通過兩對二硫鍵形成4 個穩定的α 螺旋結構（A-D），其中A、C、D 是疏水性螺旋，參與結合促紅細胞生成素受體（erythropoietin receptor，EPOR）。已在多種非紅系組織中檢測到EPO 和EPOR，提示EPO 具有非造血作用[4]。

EPOR 相對分子量為66 kDa，屬于Ⅰ型細胞因子受體超家族，主要包括三個部分：一個胞外結構域，其包含兩對提供配體結合位點的半胱氨酸殘基和一段保守基序（WSXWS）；一個跨膜結構域和一個缺乏催化活性的胞內結構域。在造血系統中，EPO 與其經典受體的同型二聚體（EPOR）2結合并激活胞漿中的Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2），活化的JAK2 使EPOR 胞漿結構域中的8 個酪氨酸殘基磷酸化，隨后激活幾種次級信號分子：信號轉錄激活因子5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT5）、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），從而促進紅系祖細胞增殖、分化為成熟的紅細胞，發揮其主要的造血功能[5]。

2 EPO 衍生物與β 共同受體（Common β chain receptor，βCR）

第一個非促紅EPO 衍生物是去唾液酸EPO（asialo-EPO），其糖鏈末端缺乏唾液酸殘基保護，極易被肝臟中脫唾液酸蛋白受體識別從而被快速代謝，血漿半衰期由普通EPO 的約6 h 降至幾分鐘。值得一提的是，雖然組織保護性受體對EPO 的親和力明顯低于促紅受體，但短暫接觸足以誘導神經保護作用的產生。而EPO 發揮促紅作用需要長時間結合（EPOR）2，造成這種差異的原因尚未完全確定[6]。因此，asialo-EPO 理論上可以發揮組織保護作用而不產生促紅作用，但原則上它仍然能夠激活（EPOR）2，多次大劑量的使用仍可能影響紅細胞生成，且不利于深入研究EPO 保護作用機制，所以人們希望能夠制備一種不與（EPOR）2結合但仍具有組織保護作用的EPO 衍生物[7]。

氨甲酰EPO（carbamylated erythropoietin，CEPO）即被開發出來，其是EPO 賴氨酸殘基氨甲酰化的產物，也是第一個真正意義上被嚴格證實不具有促紅活性的EPO 衍生物，因其既不與同二聚體（EPOR）2結合也不與單體EPOR 結合。但它仍然在包括大腦、心臟和腎臟等器官中呈現出與EPO 和asialo-EPO 相似的組織保護作用，Brines 等[8]認為這種組織保護作用是由EPOR與βCR 組成的異質二聚體EPOR/βCR 介導的。

βCR，又名CD131，與EPOR 同屬于Ⅰ型細胞因子受體超家族，是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GMCSF）、白細胞介素（interleukin，IL）-3 及IL-5 等的共享受體[9]。已在包括神經系統、心臟、腎臟在內的多種組織器官中檢測到EPOR 和βCR 的共表達，并證明了EPO 通過結合EPOR/βCR 介導組織保護作用[10]。

低唾液酸EPO（neuro-EPO）是唾液酸含量在4～7 mol/mol 的重組EPO 亞型，目前已進入腦部疾病的臨床研究，主要通過鼻內途徑進行給藥[11]。在神經疾病治療中，對于以唾液酸含量為出發點設計的EPO衍生物與EPO 本身，鼻腔給藥是更理想的給藥方式，因其可以繞過血腦屏障將藥物直接遞送至大腦，同時避免被肝臟代謝，所以只需給予較低劑量的EPO 即可發揮神經保護作用，大大降低了促紅作用帶來的血栓形成等風險，且起效更快[12]。

對EPO 構效關系的研究表明，螺旋B 遠離EPO與EPOR 的結合位點，Brines 等[13]模擬了螺旋B 外部的親水性表面，設計了一段包含11 個氨基酸殘基的線性小分子多肽，即螺旋B 表面肽（helix B surface pep tide，HBSP），又名ARA290，其N 末端谷氨酰胺自發環化形成焦谷氨酸HBSP（pyroglutamate HBSP，pHBSP），由此具有更高的穩定性。與CEPO 相似，pHBSP 同樣不與EPOR 結合，已證明其通過結合EPOR/βCR 在腎臟、大腦、心臟、肺等器官中發揮組織保護作用[14]。基于EPO 結構及其多樣性受體的進一步研究，其他EPO模擬肽也在陸續開發中，包括Epobis、Epotris、JM-4、MK-X、NP1 和NP2 等[15]。

3 EPO 的神經保護作用及其機制

目前對EPO 在神經系統中作用與機制的研究，大量集中在缺血性腦損傷、阿爾茨海默癥（Alzheimer′s disease，AD）和帕金森癥（Parkinson′s disease，PD）等神經退行性疾病領域。

3.1 缺血性腦損傷

缺血性腦損傷的病理特征是細胞能量儲備耗竭，引起Na+/K+泵衰竭、電壓控制鈣通道開放及谷氨酸釋放并激活脂酶、一氧化氮（nitric oxide，NO）合成酶等，導致NO 過量產生、氧自由基生成及炎癥細胞因子釋放，最終激活半胱氨酸蛋白酶（cysteine aspartate-specific protease，Caspase）及其他凋亡分子，導致細胞死亡[16]。臨床前研究表明EPO 在體內外均能抵抗由缺血和缺氧引起的神經元死亡，這取決于多種不同的機制，包括：抑制缺氧缺血導致的腦組織中NO 含量激增；上調抗氧化酶活性，保護大腦免受氧自由基的侵害，并改善高氧誘導的髓鞘缺陷[17]；抑制谷氨酸的細胞外釋放；減輕炎癥反應，下調IL-1、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 及IL-6 等炎癥細胞因子的表達；保護神經膠質細胞及海馬神經元，抵抗腦細胞凋亡[18]。

對EPO 在新生兒大腦中產生抗凋亡作用的相關分子機制的研究如下：缺氧上調少突膠質細胞及海馬神經元上EPOR 的表達，EPO 與EPOR 結合后磷酸化JAK2，隨后激活下游相關信號通路，如：PI3K、STAT5、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）及MAPK家族中的胞外信號調節激酶 （extracellular signal-reg ulated kinases，ERK），這些信號通路的激活能夠增強抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL 的表達，進而維持線粒體外膜通透性，阻止細胞色素C（Cytochrome C）的釋放，最終抑制Caspase-9、Caspase-3 的活化，從而保護細胞免于凋亡[19]。此外，EPO 還具有促神經發生與血管生成的作用，這種作用的產生部分來源于EPO 對血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達上調及對VEGF/VEGFR-2 信號通路的激活[20-21]。

3.2 AD

AD 的病理特征是β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ） 在神經元細胞外異常沉積形成的老年斑及tau 蛋白過度磷酸化形成的神經元纖維纏結，臨床表現多為認知功能下降及記憶力減退等[22]。AD 是第二大最為常見的神經退行性疾病，其病理特征是中腦黑質多巴胺能神經元死亡及黑質殘存神經元胞質內出現嗜酸性包涵體，即路易小體，其主要成分是α 突觸核蛋白[23]，臨床表現多為運動遲緩、肌強直及靜止性震顫等[24]。盡管兩者發病機制不同，但具有相似的演變過程：興奮性毒性、氧化應激、神經炎癥、線粒體功能障礙、神經元死亡和反應性膠質化[21-24]，已證明EPO能夠抵抗這些變化從而改善臨床癥狀[25]。

以AD 為例，簡要闡述EPO 發揮以上作用的具體表現及部分分子機制[26]（圖1）。將PC12、SH-SY5Y 細胞系及海馬神經元原代培養物暴露于Aβ 肽或其片段（如Aβ25-35）可引起氧化應激與過度磷酸化的tau蛋白（hyperphosphorylated tau，tau-p）積聚，最終導致細胞凋亡。EPO 能夠有效抵抗PC12 細胞及海馬神經元原代培養物中Aβ25-35 誘導的氧化應激與谷氨酸誘導的興奮性毒性造成的線粒體損傷，并上調Bcl-2/Bax 比值，從而抑制Caspase-3 活性與細胞凋亡。在另一項Aβ25-35 誘導的AD 細胞模型中發現，EPO 可以通過PI3K/AKT 途徑抑制由tau-p 積聚引起的糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的過度激活，而GSK-3β 可以促進凋亡蛋白的釋放[26]。在AD 患者和動物模型中，神經膠質細胞的過度活化是神經炎癥和細胞損傷的標志。活化的膠質細胞釋放大量炎癥細胞因子（如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8）與氧自由基，直接促進細胞凋亡并引發認知功能障礙，而AD 大鼠經體內注射EPO 后，炎癥反應減輕，認知功能改善[27]。

圖1 EPO 對AD 中Aβ 和tau-p 異常積聚引起的神經損傷的保護作用

3.3 PD

同樣已在多種體外及體內PD 模型中觀察到EPO的神經保護作用，EPO 可以抑制6-羥基多巴胺誘導的PC12 細胞凋亡及魚藤酮誘導的SH-SY5Y 細胞凋亡[1]。此外，EPO 對星形膠質細胞、神經元及小膠質細胞的神經保護作用機理并不相同。具體來講，EPO 通過抑制依賴于MAPK 信號通路的水孔蛋白AQP4 的表達減輕星形膠質細胞腫脹并改善血腦屏障通透性，通過降低磷脂酰絲氨酸受體表達抑制小膠質細胞反應性膠質化并間接抑制神經元凋亡[28]。促紅細胞生成素釋放神經前體細胞（erythropoietin-releasing neural precursors cells，Er-NPCs） 是心室下區來源的神經前體細胞的一個亞類，它們呈現更高的神經分化。單側紋狀體定向注射Er-NPCs 可以快速起到抗炎作用，其通過調節炎性細胞因子及抗炎細胞因子的表達，直接抵消小膠質細胞的M1 樣促炎反應并誘導M2 樣促再生作用，分化和挽救退化的多巴胺能神經元，且抗EPO 抗體與Er-NPCs 的共同注射可以中和Er-NPCs的抗炎作用，這表明Er-NPCs 的抗炎活性是由其釋放的EPO 介導的[29-30]。最新研究發現，EPO 還可以通過加快糖酵解速率提升細胞內ATP 水平，以挽救線粒體損傷并改善氧化還原失衡和神經炎癥，最終抑制多巴胺能神經元變性，恢復其細胞活力[31]。

4 EPO 衍生物的神經保護作用及其機制

考慮到本綜述的部分目的在于比較結構與作用方式差異較大的EPO 及其衍生物的神經保護作用與機制，因此本部分主要以pHBSP 作為敘述對象。對于asialo-EPO 與neuro-EPO，盡管兩者通過降低唾液酸化水平顯著縮短了血漿半衰期，但理論上二者仍可以結合（EPOR）2，多次大劑量的給藥依然具有高血壓與血栓形成等風險[26]，因此不是理想的神經保護劑。不過值得一提的是，neuro-EPO 通過鼻腔給藥的方式似乎完全規避了這種風險，并已在臨床試驗中顯示出有益效果，遺憾的是，目前尚不明確鼻腔給藥下neuro-EPO 的藥物動力學[11]。CEPO 已被多項研究證明即使在長期給藥下也不會產生促紅作用，并在多種神經疾病中顯示出保護作用[32]。但CEPO 存在生產成本高、結構不穩定及潛在的抗體形成等問題，限制了其在臨床治療中的應用[33]。而pHBSP 作為一段僅與EPOR/βCR 特異性結合的只有11 個氨基酸組成的小分子多肽顯然更具優勢，包括更容易穿越血腦屏障等，且雖然靜脈注射后其血漿半衰期只有幾分鐘，但仍可以發揮持續的生物學效應，這可能部分依賴于參與其作用機制的相關信號通路[14]（圖2），比如持久存活途徑PI3K/AKT 的激活可能介導了pHBSP 較長時間的組織保護作用[14]。

圖2 pHBSP 的生物活性涉及細胞內多條信號通路

已在體外、體內及臨床試驗中觀察到pHBSP 的神經保護作用且均未觀察到高血壓與血栓形成等副作用。體外研究表明EPO 可以抑制運動神經元中卡因酸誘導的谷氨酸興奮性毒性[13]。在癲癇持續狀態大鼠模型中，pHBSP 可以促進海馬神經元的分化和存活并改善癲癇大鼠的認知缺陷[34]。在一項針對22 名結節病患者的雙盲、隨機、對照試驗中，靜脈注射pHBSP第4 周，疼痛強度和小纖維神經病變篩查列表（small fibroneuropathy screening list，SFNSL） 評分顯著降低，表明pHBSP 可以減輕結節病患者中的小纖維神經病變[35]。對患有神經病變癥狀的2 型糖尿病患者皮下注射pHBSP，受試者表現出血紅蛋白A1c 和脂質分布的改善，通過PainDetect 調查表評估的神經病理性疼痛也得到了顯著降低，表明pHBSP 有助于改善2 型糖尿病患者的代謝控制和神經病變[36]。

5 小結

綜上所述，EPO 是一種復雜的多效性細胞因子，其作用取決于細胞類型、給藥濃度與生理狀況等具體的反應環境。在神經系統中，EPO 以上述環境依賴性的方式結合多種受體并激活相應的信號級聯以實現神經保護與神經修復功能。盡管在具體細胞與具體損傷類型中的作用不盡相同，但可以概括地表述為抗氧化、抗炎與抗凋亡，這些共性的作用提示了EPO 在神經退行性疾病中的治療潛力。為避免促紅作用帶來的血栓形成等風險，特異性地針對組織保護性受體的EPO衍生物被開發出來，已在神經退行性疾病的動物模型與臨床研究中觀察到EPO 及其衍生物產生的有益效果。此外，鼻腔給藥也是一種可行的途徑，其臨床限制性主要體現在相關藥動學與藥效學尚未明確。總之，EPO 具有明顯的神經保護作用，對其構效關系與多樣性受體的進一步研究促進了非促紅EPO 衍生物的開發，進一步闡明了EPO 的神經保護作用機制，同時為多種神經疾病的臨床治療提供了有效的解決方案。