鴉膽子和水飛薊主要活性成分對苯妥英代謝的抑制作用研究

陳悅悅 劉 勇 陳銀楠 李 巍▲

1.揚州大學醫學院轉化醫學研究院，江蘇揚州 225009；2.大連理工大學生命科學與藥學學院，遼寧盤錦 124221

苯妥英是治療癲癇持續性發作的重要二線藥物[1-2]。其代謝清除主要由人肝微粒體細胞色素P450（cytochrome P450，CYPs）超家族的CYP2C9 和CYP2C19負責，其中CYP2C9 貢獻率達90%[3]。苯妥英治療窗窄，血藥濃度易受同服藥物影響[3]，尤其在惡性腫瘤合并癲癇的患者中，同服多種藥物存在基于對肝微粒體CYPs 抑制而導致苯妥英血藥濃度提高，進而引起不良反應發生的風險[4]。鴉膽子油軟膠囊和鴉膽子油乳注射液是已上市的應用于腫瘤輔助治療的中成藥[5-6]，其抗腫瘤的主要活性成分是鴉膽子苦醇和鴉膽子素D[7-8]。此外，水飛薊是國內外多種護肝保健品中的主要活性成分，也是用于治療抗腫瘤藥物導致肝損傷的重要藥物之一[9-10]。水飛薊賓A 和水飛薊賓B 是其發揮抗氧化、抗纖維化和肝臟保護等作用的重要物質基礎[11]。鴉膽子和水飛薊制劑與苯妥英在癲癇合并腫瘤患者中均存在聯合使用的可能，但上述活性成分對人肝微粒體CYPs 催化苯妥英代謝的影響尚無相關報道。本研究使用人肝微粒體體外孵育體系，探討鴉膽子苦醇、鴉膽子素D、水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對CYPs 催化苯妥英代謝的抑制作用，并為以服用中藥為輔助藥物治療的臨床惡性腫瘤合并癲癇患者提供參考依據，以避免臨床中藥-西藥相互作用導致的不良反應的發生。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

QTRAP 6500+三重四級桿液相質譜聯用儀（美國AB SCIEX 公司）：配有電噴霧離子化源（ESI）和Analyst 1.4.2 數據處理軟件；ExionLCTM 超高效液相色譜儀（美國AB SCIEX 公司）：配置四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱；VORTEX-2 渦旋振蕩器（美國Scientific Industries 公司）；AUY120 電子天平（島津國際貿易有限公司）；SY-1220 恒溫水浴槽（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；ThermoStat C 恒溫孵育器（美國eppendorf 公司）。

人肝微粒體（批號：201801SUBK）購自上海瑞德肝臟疾病研究有限公司；氯化鎂（批號：20150202）購自國藥集團化學試劑有限公司；苯妥英（批號：C1512060）、甲酸（批號：H2014333）購自阿拉丁公司；傘形酮（批號：BCCC1923）和5-（4 羥基苯基）-5-苯基乙內酰脲（p-HPPH）（批號：0021309）購自美國Sigma公司；1-氨基苯并三唑（批號：41043）購自Medchem Express 公司；乙腈（批號：20230531）和甲醇（批號：20230331）購自德國Merck 公司；水飛薊賓A（批號：K1610034）、水飛薊賓B（批號：CFS201902）購自武漢中標科技有限公司；鴉膽子苦醇（批號：P12J10F79833）、鴉膽子素D（批號：Y08M631）和還原型輔酶Ⅱ（NADPH，批號：B29N8T49218）購自上海源葉公司；純度均大于98%。其他的試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 水飛薊賓A、水飛薊賓B、鴉膽子苦醇和鴉膽子素D 均用乙腈分別溶解稀釋成三種濃度梯度（1.000、5.000 和10.000 mmol/L）的工作液待用。另將水飛薊賓A 和水飛薊賓B 用乙腈分別配制成濃度梯度為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 和8.000 mmol/L 的工作液。CYPs 廣泛抑制劑1-氨基苯并三唑（ABT）用乙腈稀釋成濃度為5.000 mmol/L 的儲備液備用。另使用乙腈配制4.000 mmol/L 的苯妥英工作液，20.000 mmol/L 傘形酮工作液。使用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCL，100.000 mmol/L，pH=7.4）配制50.000 mmol/L NADPH 工作液，上述溶液均保存于-20°C。蒸餾水配制500.000 mmol/L 的氯化鎂工作液，臨用臨配。

1.2.2 水飛薊賓A、水飛薊賓B、鴉膽子苦醇和鴉膽子素D 對人肝微粒體CYPs 催化的苯妥英代謝的抑制作用 鴉膽子苦醇、鴉膽子素D、水飛薊賓A、水飛薊賓B 和空白對照（乙腈）中分別加入Tris-HCl 緩沖液（pH 7.4，終濃度為100.000 mmol/L）、人肝微粒體（終濃度為0.100 mg/ml）、苯妥英（終濃度為20.000 μmol/L）和氯化鎂（終濃度為5.000 mmol/L），37℃預孵育3 min后，加入NADPH（終濃度為1.000 mmol/L）起始反應，繼續孵育40 min 后通過加入200.000 μl 含內標（0.200 μmol/L 的傘形酮）的乙腈終止反應。陽性對照（廣泛CYPs 抑制劑：50.000 μmol/L 的ABT）與微粒體反應體系（與上述終濃度相同的Tris-HCl 緩沖液、人肝微粒體、氯化鎂和NADPH）預孵育30 min，然后加入苯妥英，孵育40 min 后加入200 μl 含內標的乙腈終止反應。

1.2.3 水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對人肝微粒體CYPs催化的苯妥英代謝抑制的半抑制濃度 （50% inhibiting concentration，IC50） 計算方法 向反應體系（100.000 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl 緩沖液，含苯妥英20.000 μmol/L、氯化鎂5.000 mmol/L、人肝微粒體0.100 mg/ml）中分別加入水飛薊賓A 或水飛薊賓B（0.000、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 和80.000 μmol/L），預孵育3 min 后起始反應（NADPH 1.000 mmol/L），繼續孵育40 min 后加入200 μl 含內標（0.200 μmol/L 的傘形酮）的乙腈終止反應。計算相對于0.000 μmol/L 組的剩余活性百分比。使用Graph-Pad Prism 8.0.1 進行非線性回歸，計算水飛薊賓A 或水飛薊賓B 對人肝微粒體CYPs 催化的苯妥英代謝抑制的IC50。

1.2.4 色譜條件 使用高效液相色譜和質譜儀測定苯妥英的代謝產物，采用ACQUITY UPLC?C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱分離反應混合物，柱溫35℃；采用流動相A（含0.1%甲酸的水）和流動相B（含0.1%甲酸的乙腈）進行線性梯度洗脫。洗脫條件：0～1.5 min，10%流動相B；1.5～3.5 min，70%流動相B；3.5～4.5 min，10%流動相B；流速：0.3 ml/min；進樣量：2 μl。

1.2.5 質譜條件 采用電噴霧ESI 離子源，正離子模式掃描，噴霧電壓為5500 V，碰撞氣為Medium，離子源霧化器為20 psi，加熱輔助器為20 psi，氣簾氣為35 psi，離子傳輸毛細管溫度為450℃。采用多反應監測（multiple-reaction monitoring，MRM）定量p-HPPH 和內標。用于定量的離子及碰撞能量見表1。

表1 苯妥英代謝產物和內標的多反應監測條件

1.3 觀察指標

測定苯妥英的代謝產物p-HPPH 與內標峰面積，將兩者比值帶入標準曲線并計算苯妥英代謝的反應速率。

1.4 統計學方法

實驗數據均用GraphPad Prism 8.0.1 處理，實驗結果用均數±標準差（±s）表示。使用單因素方差分析（ANOVA）進行統計學分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標準曲線

選取濃度范圍為0.005～2.500 μmol/L 的p-HPPH標準品為橫坐標，苯妥英代謝產物與內標的峰面積比為縱坐標，得到標準曲線的線性回歸方程Y=22.012X+0.205（r2=0.9994）。

2.2 水飛薊和鴉膽子主要活性成分苯妥英代謝產物p-HPPH 的抑制作用

鴉膽子苦醇和鴉膽子素D 在10.000、50.000 和100.000 μmol/L 濃度下的反應速率與0.000 μmol/L比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖1A、B）。水飛薊賓A 在10.000、50.000 和100.000 μmol/L 濃度下苯妥英代謝產物p-HPPH 的生成速率分別為4.360、0.450和0.100 pM/（min·mg）pro，低于0.000 μmol/L時的14.060 pM/（min·mg）pro，差異有統計學意義（P＜0.05）。水飛薊賓B 在10.000、50.000 和100.000 μmol/L濃度下p-HPPH 的生成速率分別為5.940、0.002 和～0.000 pM/（min·mg）pro，低于0.000 μmol/L 時的12.500 pM/（min·mg）pro，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1C、D）。

圖1 鴉膽子苦醇、鴉膽子素D、水飛薊賓A 和水飛薊賓B 分別在不同濃度時對苯妥英代謝產物p-HPPH 生成速率的影響

2.3 水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對p-HPPH 生成抑制的IC50

為進一步獲得水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對人肝微粒體CYPs 催化苯妥英生成p-HPPH 抑制的IC50，分別計算上述兩化合物濃度為1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 和80.000 μmol/L 時對苯妥英代謝產物p-HPPH 生成的抑制率。非線性回歸獲得水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對p-HPPH 生成抑制IC50分別為7.670 μmol/L 和15.490 μmol/L。

3 討論

苯妥英是臨床最常用的抗癲癇藥物之一，主要由CYP2C9 代謝。由于其治療窗窄，且藥代動力學曲線呈非線性，因此苯妥英血藥濃度的微弱變化均可顯著影響其療效和毒副作用[12]。臨床中很多癲癇患者在服用苯妥英治療的同時也服用了中藥作為輔助治療，因此增加了藥物相互作用的風險[13-14]。因而在體外研究苯妥英與中藥的具體活性成分的相互作用具有重要的臨床意義。本研究探討鴉膽子苦醇和鴉膽子素D對苯妥英代謝的影響，結果顯示鴉膽子苦醇和鴉膽子素D 對苯妥英代謝無明顯抑制作用，提示上述化合物與苯妥英共服時可能不會發生基于CYPs 抑制而導致的苯妥英藥代動力學性質的改變。目前尚未有研究報道鴉膽子苦醇和鴉膽子素D 在體內主要由何種酶代謝，由此結果可推測催化苯妥英代謝的CYP2C9和CYP2C19 可能在代謝鴉膽子苦醇和鴉膽子素D 中發揮的作用較小。

水飛薊活性成分制劑在國內常作為保肝處方藥使用。此外，國內外也將其作為保健品食用，人們通常認為其安全無副作用，因而忽視藥物相互作用造成的影響。目前已有研究和病例報道證實水飛薊可以抑制CYP2C9 底物甲苯磺丁脲和華法林的代謝[15-17]，但水飛薊與苯妥英的相互作用并不清楚。本研究探討水飛薊的主要成分水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對苯妥英代謝的影響，證實水飛薊賓A 和水飛薊賓B 可抑制人肝微粒體CYPs 催化的苯妥英代謝。中藥對CYP2C9酶的抑制程度可大致分為強抑制（IC50＜10 μmol/L）、中等抑制（10 μmol/L＜IC50＜50 μmol/L）、弱抑制（IC50＞50 μmol/L）[17]。本研究結果顯示，水飛薊賓A 是p-HPPH生成的強抑制劑（IC50=7.670 μmol/L），水飛薊賓B 為中等強度抑制劑（IC50=15.490 μmol/L）。與以往水飛薊賓B 對CYP2C9 底物華法林代謝的抑制作用強于水飛薊賓A 的結果相反[18]。相關機制仍有待進一步研究。

健康志愿者在服用120 mg 水飛薊制品后，體內水飛薊賓濃度最大可達12.5 μmol/L[19]。因此可推測水飛薊賓A 和水飛薊賓B 在體內極有可能抑制苯妥英的代謝而引起臨床不良反應的發生。但中藥由于其復雜性，吸收進入體內的量并不清楚，因此體內和體外的差異性問題仍值得關注。水飛薊賓A 和水飛薊賓B抑制苯妥英的代謝也仍需進一步的臨床研究證實其相關性。CYP2C9 和CYP2C19 均具有高度多態性，也是影響苯妥英代謝的主要原因之一[20]。目前已證實攜帶一個或兩個有缺陷的CYP2C9 等位基因的個體在使用常規劑量苯妥英治療時更易發生中樞神經系統不良反應和嚴重的皮膚不良反應[21]。本研究僅以人肝微粒體探究了水飛薊賓A 和水飛薊賓B 對苯妥英代謝的影響，水飛薊賓A 和水飛薊賓B 在CYP2C9 的突變體體系中對苯妥英的影響值得進一步深究。

綜上所述，水飛薊賓A 和水飛薊賓B 與苯妥英共服時可能通過抑制CYPs 增加體內苯妥英血藥濃度，進而引發臨床不良反應的風險，對于預測中藥-西藥相互作用，為指導臨床中藥-西藥合理聯用在治療腫瘤合并癲癇的患者中具有重要意義。