三角梅CHS基因的克隆及表達分析

孫 蓉，劉 姍，高靜雷，刁 毅，姜少娟，王勝男

(攀枝花學院 生物與化學工程學院,四川攀枝花 617000)

三角梅是中央種子目(Centrospermae)紫茉莉科(Nyctaginaceae)葉子花屬(Bougainville)的一類常綠藤狀灌木[1]。其色澤艷麗，花量繁盛，花型獨特，四季開花，且耐旱耐鹽，少病蟲害，抗逆性強，可用于盆栽、綠籬也可用于園林綠化等[2]。作為景觀植物，花色改良是其重要的育種目標，目前三角梅觀賞品種約有100多個[3-4]，有紅色系、橙色系、粉紫色系及白色系等[5]，但缺乏稀有的藍 色花。

安田斉[6]認為藍色花色的產(chǎn)生需要多個條件結(jié)合，包括大量的飛燕草素，適合的液泡pH及適量的助色素等，其中飛燕草素的積累是主要條件。研究表明利用基因工程技術向非藍色花植物中引入飛燕草素合成途徑關鍵酶基因可實現(xiàn)藍色花色的培育，例如Holton[7]和Fukui等[8]將紫羅蘭中飛燕草素合成的關鍵基因類黃酮-3′-5′-羥基化酶(flavonoid-3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)轉(zhuǎn)入白色康乃馨后獲得了藍紫色的花。同樣地Katsumoto等[9]在月季中轉(zhuǎn)入外源F3′5′H基因后飛燕草素開始積累，最終得到了藍色的月季。而篩選適合的外源基因轉(zhuǎn)入受體是關鍵。

查爾酮合酶(chalcone synthase,CHS)是花青素苷合成途徑中的第一個關鍵酶及限速酶[10](圖1)，催化3分子丙二酰輔酶A(malnoyl CoA)與1分子4-香豆酰輔酶A(4-coumaroyl-CoA)生成查爾酮(chalcone)，可為飛燕草素的合成提供基本的碳骨架。因此本研究基于前期三角梅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選克隆CHS基因，利用MEGA5.05、ProParam、DNAMAN、Swiss-Model等生物信息學工具預測其蛋白的分子特性，并采用qRT-PCR技術分析基因表達特異性，為該基因的表達調(diào)控及功能驗證提供基礎材料，為藍色三角梅轉(zhuǎn)基因受體的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇1～2 a生完全木質(zhì)化，粗細長短相近的各色系單色單瓣三角梅[白色的‘新加坡大白(B.glabra‘Singapore White’)’，粉紅色的‘中國麗人(B.×buttiana‘China Beauty’)’，紅色的‘花葉大紅(B.×buttiana‘Brilliant Variegata’)’，橙色的‘寶老橙(B.×buttiana‘Baolao Cheng’)’，黃色的‘黃蝶(B.×spectoglabra‘Ratana Yellow’)’及紫色的‘安格斯(B.‘Elizabeth Angus’)’]枝條于2018年6月扦插種植于攀枝花學院苗圃，以盛花期的苞片和葉片為試驗材料。

1.2 查爾酮合酶基因的克隆

根據(jù)干熱河谷特色生物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室測序獲得的白色三角梅苞片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以注釋信息、基因表達豐度、序列長度等為條件，篩選花青素合成途徑中的CHS基因，手動篩除不同注釋庫的重復項，并通過BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對確定完整性。根據(jù)所得序列設計一對特異引物，上游引物BsCHSF:ATGAATTCTCCATCACTTGATGAAA及下游引物BsCHSR:TTATAGTGGAACACTATGAAGCACA。以白色三角梅葉片cDNA第一鏈為模板，利用PrimeSTAR Max DNA Polymerase (TaKaRa)擴增BsCHS基因cDNA全長，25 μL反應體系中PrimeSTAR Max Premix (2×) 12.5 μL，BsCHSF (10 μmol/L) 0.5 μL，BsCHSR(10 μmol/L) 0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL；PCR反應程序：98 ℃變性10 s；55 ℃退火 5 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)后，為保證充分擴增72 ℃繼續(xù)延伸10 min。利用超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒(天根)純化回收PCR產(chǎn)物，送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序驗證。

1.3 序列分析

利用DNAMAN軟件結(jié)合WebLoGo (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)在線系統(tǒng)解析CHS保守基序的序列特征；通過SMART (http://smart.embl.de/)在線工具搜索功能結(jié)構(gòu)域；采用ExPASy系統(tǒng)的ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)和SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)工具分析表達蛋白的基本理化性質(zhì)及三級結(jié)構(gòu)；應用CBS研究所在線預測服務系統(tǒng)的TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM- 2.0/)和SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)工具預測表達蛋白的跨膜區(qū)域及信號肽；SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sspred.html)方法用于預測二級結(jié)構(gòu)；使用MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，建樹方法為比鄰法(Neighbor-Joining)，自舉重復(Bootstrap replications)的重復次數(shù)為1 000次。

1.4 基因表達量分析

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個花色葉片及苞片進行2次生物學重復，3次技術重復。以表達量最低的材料為對照，利用2-ΔΔCT法計算目的基因在不同花色中的相對表達量，并通過SPSS 20.0進行顯著性分析，Origin 2018軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三角梅CHS基因的克隆

根據(jù)三角梅轉(zhuǎn)錄組注釋信息庫的基因名稱和功能注釋，成功篩選獲得了1條CHS基因序列(Bs104454)，通過BLAST比對顯示Bs104454基因開放閱讀框完整且與其他植物CHS同源，根據(jù)該序列設計引物，擴增獲得了一條長為1 176 bp的cDNA序列，編碼392個氨基酸，測序結(jié)果與預期相吻合，將其命名為BsCHS，提交GenBank，登錄號為MT302539(圖2)。

2.2 BsCHS蛋白基本理化性質(zhì)分析

根據(jù)ProtParam工具預測，BsCHS理論相對分子質(zhì)量為43.96 ku，等電點為6.24，含量最多的氨基酸為亮氨酸(Leu)含10.5%，其總負電荷殘基數(shù)為50，正電荷殘基數(shù)為45，分子式為C1964H3129N537O568S19，總原子數(shù)為6217，不穩(wěn)定系數(shù)及平均總親水系數(shù)分別為53.18和-0.067，表明BsCHS為不穩(wěn)定的親水性蛋白。

2.3 BsCHS蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 保守結(jié)構(gòu)域 不同植物間，查爾酮合酶蛋白較為保守，相似性為74%～98%，多序列比對結(jié)果(圖3)與此相符合，BsCHS與其余植物中CHS序列相似性為85.43%，具有CHS特有的保守基序(圖4)，在這些區(qū)域存在4個活性中心位點，其中Cys164是底物4-香豆酰輔酶A(4-coumaroyl-CoA)的結(jié)合位點；His303和Asn336主要參與催化底物丙二酰輔酶A(malnoyl CoA)脫羧的反應；Phe215與底物特異性選擇相關[12]。

2.3.2 信號肽及跨膜結(jié)構(gòu) 信號肽的主要作用是引導新合成的多肽在胞內(nèi)運輸，以到達不同的細胞器內(nèi)，具有指導多肽跨膜轉(zhuǎn)移的作用。經(jīng)SignalP 5.0在線工具預測顯示BsCHS不含有信號肽序列，TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)的預測結(jié)果也與此相符，不含有跨膜結(jié)構(gòu)。進一步利用ProtCompv.9.0預測其亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)定位于細胞質(zhì)，該結(jié)果與上述結(jié)果相吻合。說明BsCHS為非分泌型的細胞質(zhì)蛋白。

2.3.3 功能結(jié)構(gòu)域及二級結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)域是一種介于二級和三級結(jié)構(gòu)之間的蛋白功能單元，不同的結(jié)構(gòu)域往往與不同的功能相聯(lián)系，結(jié)構(gòu)域信息對于預測蛋白質(zhì)間相互作用具有重要價值[13]。利用SMART在線工具預測BsCHS結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示其含有4個結(jié)構(gòu)域，其中Chal_sti_synt_N和Chal_sti_synt_C為查爾酮合酶特征結(jié)構(gòu)域，富含活性位點，與底物特異結(jié)合有關，C端的活性差異與N端序列的差異有關。另外兩個為FAE1_CUT1_RppA和ACP_syn_Ⅲ與脂肪酸合成 相關。

由SOPMA預測結(jié)果可知(圖5)，BsCHS二級結(jié)構(gòu)組成中比例最高的為α螺旋，占44.25%；其次為無規(guī)則卷曲占36.06%，延伸鏈占 14.32%，最少的為β轉(zhuǎn)角占5.37%。

2.3.4 BsCHS三級結(jié)構(gòu)預測 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定著蛋白質(zhì)的功能，因此研究其高級結(jié)構(gòu)對認識蛋白質(zhì)功能，了解蛋白質(zhì)作用方式具有重要意義[14]。利用SWISS-MODEL在線預測系統(tǒng)的同源建模法構(gòu)建BsCHS的三級結(jié)構(gòu)，參考模板為水稻(OryzaSativa)中的4yjy.1.A查爾酮合酶，序列相似性為57.62%。結(jié)果顯示(圖6)BsCHS為二聚體蛋白，各二級結(jié)構(gòu)含量也與SOPMA預測結(jié)果相吻合。

2.4 BsCHS蛋白的分子進化分析

以單子葉植物玉米CHS蛋白序列為外類群，與薔薇目的大豆、綠豆，管狀花目的煙草、黃芩，百合超目的虎眼萬年青、黑麥，蓼目的虎杖、苦蕎麥，以及中央種子目的甜菜、菠菜、石竹等中的CHS蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示(圖7)雖BsCHS蛋白單獨聚為一支，但與同為中央種子目的植物親緣關系較近，符合系統(tǒng)進化關系。

2.5 BsCHS在不同花色中的表達模式

利用qRT-PCR技術檢測BsCHS基因在不同顏色三角梅苞片及葉片中的表達情況(圖8)，以表達量最低的紅色葉片為參照，進行其他材料中表達量的計算。結(jié)果顯示BsCHS基因在黃色、白色及紫色三角梅中表達量較高，其中在黃色三角梅葉片及苞片中的表達量是紅色葉片的24倍及22倍，而粉色苞片中的表達量是葉片中的10倍。大部分苞片表達量高于葉片，因此推測苞片比葉片更適用于研究三角梅花青素合成途徑，且黃色及白色可優(yōu)先考慮作為藍色三角梅轉(zhuǎn)基因受體，但還需進一步對其色素種類及含量進行研究來確定。

3 討 論

隨著人們生活水平的不斷提高，對新異花卉品種的追求越來越強烈，其中藍色花卉更是廣受歡迎。研究表明藍色花的形成需要一種花青素——飛燕草素及適合的呈色環(huán)境。三角梅之所以沒有藍色的花，主要原因是使其呈色的色素為甜菜色素，該色素與花青素排斥分布，在同一植物中無法同時合成這兩種色素[15]。但有報道顯示積累甜菜色素的植物也可以合成黃酮，類黃酮甚至原花青素，而其最后一步花青素合酶的缺失可能是導致其不能合成花青素的原因[16]。基于基因工程手段的分子育種可打破此現(xiàn)狀，通過對代謝途徑的調(diào)控改造達到目的產(chǎn)物的合成，從而實現(xiàn)花色定向培育。然而花青素合酶的轉(zhuǎn)化需要受體本身可以合成其催化底物。CHS作為花青素合成途徑的核心酶，一方面其可以為花青素苷的合成提供前體物質(zhì)，另一方面其自身表達量的高低也會影響花色的呈現(xiàn)[17]。因此研究花卉CHS基因?qū)ㄉ牧季哂兄匾饬x。

中央種子目植物(除了石竹科Caryophyllaceae和粟米草科Molluginaceae)是被子植物中唯一一個以甜菜色素為主要花色素的目，其中藜科已有CHS基因序列的相關報道，而紫茉莉科中尚未見報道，本研究首次從紫茉莉科植物中獲得了CHS基因。該基因含有一個1 176 bp的開放閱讀框，編碼43.96 ku的蛋白，對其三級結(jié)構(gòu)的預測表明其含有2個亞基，該結(jié)果與Springob等[18]的研究結(jié)果相符，他們通過X-射線衍射研究

CHS蛋白三維結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)CHS是一個二聚體蛋白，且每個亞基分子質(zhì)量在40～50 ku之間；對蛋白性質(zhì)預測結(jié)果表明BsCHS為親水性蛋白，與方建[19]及馮立娟等[20]對CHS基因克隆研究結(jié)果一致；通過信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細胞定位分析，BsCHS屬于細胞質(zhì)蛋白符合前人報道[21]；序列比對及結(jié)構(gòu)域分析表明BsCHS含有查爾酮合酶特征保守結(jié)構(gòu)域及活性中心保守氨基酸，以上結(jié)果顯示本研究篩選獲得的三角梅CHS基因符合植物CHS基因特性，具有CHS生物活性，可用于后續(xù)研究。

次生代謝物的合成需要經(jīng)過多個復雜且多分支的途徑，對這些途徑中限速酶的研究鑒定是解析代謝途徑的關鍵步驟。關鍵酶基因表達量的高低會影響代謝產(chǎn)物的積累，因此本研究利用qRT-PCR技術檢測了BsCHS基因在不同花色三角梅中的表達情況，以期獲得最適的轉(zhuǎn)基因受體，結(jié)果顯示在黃色三角梅苞片及葉片中BsCHS的表達量均較高，推測其可以為飛燕草素的合成提供更多的前體物質(zhì)，更適用于三角梅花青素合成途徑的研究，后續(xù)可通過高效液相色譜等方法進行代謝物含量測定以驗證該推測。

花色改良一直是花卉育種者的研究熱點，傳統(tǒng)育種方式受到多種因素的限制，難以有大突破，基于現(xiàn)代生物技術的分子育種為花卉育種提供了新思路。本研究對三角梅CHS基因的研究，為三角梅新花色的培育提供了新方向，但仍需進一步對BsCHS基因功能進行驗證及研究如何抑制甜菜色素合成途徑讓代謝流進入花青素合成途徑，才能最終達到對藍色三角梅培育的目的。