梭梭 HaNAC20基因克隆及特性分析

周亮第，姚正培，楊文艷，劉 豪，張振清，王 波，任燕萍，張 樺

(新疆農業大學 農學院,烏魯木齊 830052)

梭梭(HaloxylonammodendronBunge)是藜科(Chenopodiaceae)梭梭屬(Haloxylon)超旱生植物，它生長在荒漠和半荒漠地區，具有較強的抗旱、耐極端溫度、耐鹽堿、耐貧瘠等生態適應性[1]，被稱為“沙漠衛士”，在防風固沙、保護生態環境、改善小氣候方面具有不可替代的作用[2]。干旱一般被認為是影響梭梭幼苗成活的主要因素，而在荒漠極端環境條件下，導致梭梭自然更新困難的主要因素還有地表高溫對其幼苗和幼株存活的影響。Yu等[3]通過模擬地表高溫脅迫試驗發現地表高溫是影響梭梭幼苗存活的主要原因之一。深入探究梭梭抗逆分子機制、挖掘相關抗逆基因對于充分發掘梭梭植物資源潛力及提高梭梭種植中的幼苗存活率具有重要意義。NAC轉錄因子是陸生植物特有的、成員最多的轉錄因子家族之一，其名稱由均含有NAC結構域的矮牽牛NAM、擬南芥ATAF1/2及CUC基因首字母縮合而成[4]。典型的NAC蛋白N端是一個高度保守的可結合DNA的NAC結構域，包含大約150個氨基酸殘基，構成A～E5個亞結構域，C端是一個高度可變的轉錄調節區[5]。近年來，隨著基因組測序技術的發展，擬南芥(Arabidopsisthaliana)[6-7]、水稻(Oryzasativa)[8-10]、葡萄(Vitisvinifera)[11]、煙草(Nicotianatabacum)[12]、玉米(Zeamays)[13]，馬鈴薯(Solanumtuberosum)[14]，紫花苜蓿(Medicagotruncatula)[15]，大豆(Glycinemax)[16-17]等多種植物的NAC家族成員得以鑒定。對NAC基因的表達特性及生物學功能研究表明，NAC轉錄因子在植物側根發生[18]、細胞次生壁積累[19]、木質部導管形成[20]、細胞分化控制[21]等生長發育過程中通過調節下游功能基因而行使重要作用。同時，NAC轉錄因子也廣泛參與植物響應生物和非生物逆境脅迫，已被證實NAC轉錄因子能夠響應干旱、高鹽、低溫、高溫、ABA等非生物脅迫，過表達NAC基因的轉基因植株抗逆性得到提高[5-18,22-23]。轉錄組生物信息學分析結果顯示，NAC基因家族中有約20%～25%的成員至少能響應一種脅迫[10，24-25]。由此可見，NAC轉錄因子在植物響應逆境脅迫、提高抗逆性中發揮重要作用。開展梭梭NAC基因相關研究對于深入理解梭梭抗逆機制具有重要指導意義。

本研究以梭梭為材料，克隆HaNAC20基因，并對其生物信息學特征、逆境響應特性、亞細胞定位和轉錄激活活性及轉錄激活功能域進行分析，為深入探索梭梭抗逆機制提供依據，為抗逆基因工程提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

梭梭(HaloxylonammodendronBunge)種子采集于新疆阜康沙漠植物園，室溫自然干燥后保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.2 HaNAC20克隆與生物信息學分析

根據實驗室前期梭梭干旱和模擬地表高溫脅迫轉錄組測序結果，對含有NAC結構域的序列進行差異表達分析，篩選閾值為Qvalue<0.005且|log2FoldChange|>1，選擇在轉錄組數據中響應脅迫上調表達的NAC基因Unigene序列開展本研究。以HaNAC20Unigene序列為模板，使用Primer 5.0軟件設計克隆引物(F：5′-CTTCAACCTTCGTCAATCGT-3′，R：5′-ATCTGACAGGCATTGGGCAT-3′)。提取干旱脅迫后的梭梭總RNA，以反轉錄產物cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系包括10×Buffer(含Mg2+) 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、上下游引物各2.0 μL、cDNA 模板1.0 μL、Taq酶0.5 μL、超純水15 μL，總體積為25 μL。PCR程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 1 min 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。瓊脂糖凝膠(10 g/L)電泳后，用膠回收試劑盒法(全式金公司)回收PCR產物目的條帶，連接pEASY-T1 simple載體(全式金公司)，進行 測序。

對HaNAC20基因編碼的蛋白進行生物信息學分析。使用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)進行理化性質分析，使用BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行相似序列搜索，使用PROSITE(http://prosite.expasy.org/)進行功能結構域預測，使用cNLS Mapper(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)預測核定位信號，使用DNAMAN軟件分析測序結果、識別開放閱讀框序列(ORF)、輸出多序列比對結果，使用MEGA 5軟件以NJ法構建系統發育樹分析所屬基因亞族。

1.3 HaNAC20基因不同脅迫處理下的表達量

參照劉豪[26]、宗興風等[27]的方法，培養梭梭幼苗，待幼苗根系充分生長、同化枝長度約10 cm時進行試驗處理。分別使用20% PEG6000溶液、200 mmol/L NaCl溶液、20 μmol/L IAA溶液和100 μmol/L ABA溶液處理梭梭幼苗，于處理0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h時采集梭梭同化枝作為分析基因表達量材料，液氮速凍后置于 -80 ℃冰箱保存。選取沙土中生長一致的1 a齡梭梭苗進行模擬地表高溫脅迫：用電熱帶控溫(專利號：201010283141.0)加熱地表土壤模擬地表高溫脅迫，分別在55 ℃高溫脅迫0 h、2 h、 12 h、24 h時采集根和同化枝樣品，脅迫24 h后降溫維持在 30 ℃恢復，并在脅迫后3 d、6 d和 15 d時繼續采集根和同化枝樣品，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 GFP融合表達載體構建和亞細胞定位分析

根據HaNAC20CDS序列設計引物(F：5′-CCCAGATCTGATGGATGCAAAAAGATGT-TCTAG-3′，R：5′-CGACTAGTAAACTGCTTGTAAGATATGTGTTCC-3′)，使用無縫克隆試劑盒(南京諾唯贊公司)將HaNAC20全長CDS(不含終止密碼子)連接到pCAMBIA1304載體上，構建35S::HaNAC20-GFP融合載體并轉化根癌農桿菌GV3101。使用農桿菌介導法瞬時轉化洋蔥表皮細胞[29]，在激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM 510 SYSTEM)下觀察GFP融合蛋白綠色熒光分布情況。

1.5 酵母單雜交分析轉錄激活活性及轉錄激活功能域

為分析該轉錄因子的轉錄激活活性及轉錄激活功能域，設計HaNAC20基因全長編碼區引物(F：5′-TCAGAGGAGGACCTGCATATGATGATGATGGATGCAAAAAGATGTTC-3′，R：5′-TCGACGGATCCCCGGGAATTCTTACTAAAACTGCTTGTAAGATATGTTCCCA-3′)、N端結構域編碼區引物(F：5′-TCAGAGGAGGACCTGCATATGATGATGGATGCAAAAA-GATGTTC-3′，R：5′-TCGACGGATCCCCGGGAATTCCTTCTTGTAAATTCGACATAAT-ACCC-3′)及C端結構域編碼區引物(F：5′-TCAGAGGAGGACCTGCATATGAGGCATGTAG-CAAGGACAGA-3′，R：5′-TCGACGGATCCC-CGGGAATTCCTAAAACTGCTTGTAAGAT-ATGTTCC-3′)。使用無縫克隆試劑盒(南京諾唯贊)分別將HaNAC20全長、N端、C端的編碼區序列插入到酵母表達載體pGBKT7中，重組轉化子分別命名為pGBKT7-F、pGBKT7-N、pGBKT7-C，并轉化酵母AH109感受態細胞涂布于全營養型和SD/-Trp一缺培養基上觀察生長情況，再于SD/-Trp/-His/-Ade三缺培養基中，用X-Gal染色分析轉錄自激活活性及轉錄激活功能域。

2 結果與分析

2.1 梭梭 HaNAC20基因克隆

以梭梭cDNA為模板，擴增得到985 bp的片段(圖1)。目的片段經回收、連接、轉化、測序、ORF識別及編碼蛋白翻譯，結果顯示該序列中包含長度為822 bp(GenBank登錄號：KU845314)的ORF序列，編碼273個氨基酸的蛋白序列。

2.2 HaNAC20基因的生物信息學分析

對梭梭HaNAC20基因編碼的273個氨基酸的蛋白進行生物信息學分析。ProtParam預測分析表明，該蛋白分子質量31.12 ku，含29個酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)，含33個堿性氨基酸殘基(Arg+Lys)，理論等電點8.73，總平均疏水性為-0.703，是一個親水蛋白。經BLAST序列搜索，梭梭HaNAC20基因編碼的蛋白與菠菜NAC蛋白(KNA22936)相似性為87.7%，與藜麥NAC蛋白(XP_021747028)的相似性為84.4%，與甜菜NAC蛋白(KMT07023)的相似性為 82.2%，與擬南芥NAC蛋白(AAM63330)的相似性是61%。多序列比對結果及功能結構域預測分析表明， HaNAC20蛋白N端有一個保守的NAC家族特有的結構域(分A、B、C、D、E 5個區)，而一致性低的C端是轉錄激活區(圖2-A，圖2-B)，135～167 aa處具有一個核定位信號區(圖2-C)，證明HaNAC20具有NAC轉錄因子的典型特征，是梭梭NAC轉錄因子家族成員。進而選取擬南芥、水稻和鷹嘴豆的NAC蛋白序列構建系統發生樹，結果顯示HaNAC20屬于NAC家族SNAC亞族(圖2-D)。

2.3 不同處理下梭梭 HaNAC20基因的表達 分析

采用實時熒光定量PCR分析HaNAC20基因對非生物逆境及激素處理的響應特性，結果顯示，干旱、高鹽、高溫、IAA、ABA處理均能不同程度誘導該基因上調表達。干旱脅迫后，HaNAC20基因在12 h時表達量顯著提高至未脅迫的23倍(圖3-A)。高鹽處理時，HaNAC20基因在24 h時表達量明顯上升至未脅迫的14倍(圖3-B)。模擬地表高溫脅迫時，同化枝中HaNAC20在55 ℃脅迫處理后3 d達到最大，后表達量下降(圖3-C)。而梭梭的根部在55 ℃處理后，HaNAC20在2 h表達量即達到最大，后表達量下降，15 d時恢復到脅迫前水平(圖3-D)，表明在地表高溫脅迫初期，該基因主要在根中響應，而到脅迫后期在同化枝中響應。HaNAC20基因在IAA處理時表達量呈先上升后下降趨勢，在 6 h達到最大，為未脅迫的70倍(圖3-E)；在ABA處理時表達量呈逐漸上升趨勢(圖3-F)。

2.4 HaNAC20蛋白的亞細胞定位分析

在線工具cNLS Mapper預測顯示 HaNAC20蛋白具有核定位信號，進一步采用農桿菌侵染法瞬時轉化洋蔥上表皮細胞分析亞細胞定位。結果表明，HaNAC20與GFP的融合蛋白定位于細胞核中，而空載體的GFP蛋白分布于整個細胞(圖4)，證明 HaNAC20蛋白在細胞核內行使其功能。

2.5 HaNAC20蛋白轉錄激活活性及轉錄激活功能域的鑒定

酵母單雜交試驗結果表明，在YPDA全營養型培養基及SD/-Trp一缺培養基上，含重組載體及空載體的酵母轉化子均能快速生長(圖5-B)；在SD/-Trp/-His/-Ade三缺培養基上，只有含HaNAC20完整蛋白的pGBKT7-F或含C端的pGBKT7-C重組載體的酵母轉化子能夠生長(圖5-C)，并在X-Gal顯色反應中呈現藍色，表明這兩種重組載體中的His和LacZ報告基因被激活表達。這些結果證明 HaNAC20蛋白是一個轉錄激活功能域位于蛋白C端的轉錄因子。

3 討 論

NAC轉錄因子是陸生植物特有的、成員最多的轉錄因子家族之一，其成員在擬南芥、水稻和其他植物中參與許多調控和發育過程[30]。本研究從梭梭中克隆得到HaNAC20基因，生物信息學預測及亞細胞定位試驗均表明 HaNAC20蛋白定位于細胞核中，這與其他已經驗證過的NAC轉錄因子的亞細胞定位結果一致[31-33]。在過去的研究中，許多NAC家族SNAC亞族成員被鑒定為植物應激反應中參與復雜信號傳導過程的重要組成部分，在提高植物應對干旱、高鹽、極端溫度等非生物逆境方面發揮重要作用[22]。本研究中HaNAC20經系統發育分析表明其屬于SNAC亞族，顯示其可能參與梭梭響應非生物逆境過程。已有研究表明NAC轉錄因子家族中部分成員不具有轉錄激活活性[34]，通常具有轉錄激活活性的NAC蛋白轉錄激活功能域位于C端[35]。本研究通過酵母單雜交試驗證實HaNAC20具有轉錄激活功能，并且轉錄激活結構域位于C端，表明其具有一般轉錄因子的轉錄調控功能，這與SNAC亞族基因調控下游逆境耐受功能基因或ABA信號通路基因功能相一致。各種逆境脅迫響應基因功能不同，其表達模式存在差異，已有研究顯示NAC基因可響應多種逆境脅迫及激素處理，在處理后多呈上調表達，但不同成員響應模式不盡相同[22，25，27]。本研究中HaNAC20在干旱、高鹽、地表高溫、IAA和ABA多種逆境脅迫誘導后的不同時間上調表達，在干旱、高鹽脅迫12 h后表達量顯著上升，而在ABA或IAA激素處理1～3 h后表達量即顯著提高，表明HaNAC20對激素處理更加靈敏，其在梭梭應對非生物逆境時可能作為后程調節基因發揮作用。在模擬地表高溫脅迫試驗中，HaNAC20在梭梭根與同化枝中表達模式明顯不同，同化枝中表達量直到24 h后才顯著升高，這與黑麥草NAC基因響應高溫脅迫模式基本一致[25]；然而，HaNAC20在根中響應非常迅速，2 h即大量表達，隨后逐漸下降，15 d時基本恢復正常水平，而同化枝中15 d時仍顯著上調表達，推測一方面是因為梭梭生長環境的沙土能快速將地表高溫傳導至根部誘導基因表達，另一方面，這種地上地下組織基因表達模式的時空差異對梭梭適應沙漠高溫環境具有重要意義。與梭梭中HaNAC2相比[27]，HaNAC20在響應高鹽時，響應速度及上調倍數均低于HaNAC2，但在響應高溫時，持續上調的時間更長，表明梭梭的這兩個基因功能上存在側重，推測HaNAC20在梭梭應對高溫脅迫時發揮重要作用。

迄今為止，對NAC轉錄因子的研究雖然已經取得了一定進展，但仍存在薄弱之處：雖然NAC蛋白的功能多樣化，但目前對NAC轉錄因子應對逆境的研究主要集中在參與響應干旱、高鹽、低溫等脅迫，關于NAC轉錄因子在植物應對高溫脅迫中的作用研究相對較少；梭梭因其優異的抗逆性，既是典型的野生荒漠植物，也是防風固沙的首選立地植物，其NAC轉錄因子少有報道，本研究結果可從NAC轉錄因子這個側面為揭示梭梭抗逆的分子機制提供依據，為篩選梭梭抗逆材料提供理論指導，也可為植物抗逆基因工程研究提供新的候選基因。

A.重組載體結構圖；B.YPDA全營養型培養基中生長狀況；C.酵母轉化子中 HaNAC20蛋白轉錄活性分析