HPLC 測定葡萄糖酸鋅口服液中山梨酸鉀的含量

張 蔚，鄺嘉穎，吉 薇，龍慧靜，周秀春

（廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東廣州 510225）

山梨酸鉀是經由山梨酸與碳酸鉀發生中和反應而生成的，擁有山梨酸基本的性能[1]，作為常用的防腐劑，其價格低廉、毒性小，在防腐過程中可以保持食品原本的色、香、味且營養物質不改變。雖然山梨酸鉀毒性小，但使用時仍存有一些不良反應，如皮膚刺激性反應、過敏性或者超敏性反應等，并且部分食品添加劑會超標。因此，控制山梨酸鉀的使用含量，保證其使用安全性具有重要的意義[2]。檢測山梨酸鉀含量的方法有拉曼光譜法、熒光光譜法、高效液相色譜法等，其適用范圍僅限于調味品、飲料、果醬、口服液等食品與藥品。

口服液劑內含糖、蛋白質等營養物，容易長出霉菌而發霉，為了保障口服液的質量，某些廠家會向產品中添加一定量的山梨酸鉀，達到防腐保質的目的。此前，也有很多關于口服液中山梨酸含量測定的文獻，大多數是研究中藥口服液中的多種防腐劑，但未出現過葡萄糖酸鋅口服液山梨酸含量測定的研究，而葡萄糖酸鋅口服液并非中藥制劑，并且國家并未出臺相關的檢測標準測定葡萄糖酸鋅口服液中山梨酸鉀的含量。試驗參考有關資料[3-8]，確定了最適合葡萄糖酸鋅口服液的流動相及系統配置，相比起其他檢測口服液中防腐劑的研究，該方法提高了專屬性、簡化了操作，為葡萄糖酸鋅口服液中的山梨酸鉀含量測定提供一種簡單、高效、便捷、準確度高的新方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

島津LC-20A 型四元低壓液相色譜儀及配套色譜工作站、KQ-300DE 型數控超聲波清洗器、賽多利斯BSA224S 型十萬分之一電子天平、瑞士梅特勒托利多百萬分之一電子天平等。

1.2 試劑

山梨酸鉀標準品（批號：101075-201602，含量100.0%），中國食品藥品檢定研究院提供；隨機在市面上購買的葡萄糖酸鋅口服液（批號：20180105，18060727，17092531，170601）；乙腈、甲醇，均為色譜純；水，為超純水；其他溶液均為分析純。

2 試驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：島津C18型柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液∶乙腈（75%∶25%），柱溫40 ℃，進樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測波長為262 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 標準品儲備液

精密稱取山梨酸鉀標準品約20 mg，置其于100 mL 容量瓶中，加入一部分水溶解，放入超聲波清洗儀中超聲溶解，超聲完畢冷卻到室溫后加水稀釋至刻度，搖勻，貼上標簽，作為標準品儲備液。

2.2.2 樣品溶液

精密量取樣品5 mL，置于25 mL 容量瓶中，加入一部分水溶解，放入超聲波清洗儀中超聲溶解，超聲完畢冷卻到室溫后加水稀釋至刻度，搖勻，貼上標簽，作為樣品溶液。

2.2.3 標準品輔助液

精密稱取山梨酸鉀標準品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加入一部分水溶解，放入超聲波清洗儀中超聲溶解，超聲完畢冷卻到室溫后加水稀釋至刻度，搖勻，貼上標簽，作為標準品輔助液。

3 結果與分析

3.1 色譜條件的優化

主要對流動相的類型與比例、柱溫、進樣量進行比較篩選，而流速與檢測波長不作為條件篩選，流速過大會對液相色譜儀造成壓力，1 mL/min 是最合適的流速；檢測波長是因為該方法只研究一種防腐劑，不需要同時測定幾種不同的防腐劑在口服液中的含量，參考相關學者的研究[9-10]，最后選擇波長為262 nm。理論塔板數（按山梨酸鉀峰計） 不低于4 000，山梨酸鉀與相鄰峰分離度符合要求。

3.1.1 流動相的選擇

以A 組（甲醇∶乙酸銨溶液= 5%∶95%）、B 組（乙腈∶水= 40%∶60%）、C 組（0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液∶乙腈= 80%∶20%） 為流動相進行進樣。

不同流動相的液相色譜圖見圖1。

由圖1 可知，B 組流動相組合峰形既不美觀也不對稱，而且出峰時間也過早，A 組流動相組合峰形相較C 組流動相組合而言也不夠美觀，C 組流動相組合出峰時間合適，峰形也美觀對稱，故選擇C 組：0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液∶乙腈= 80%∶20%作為流動相。

圖1 不同流動相的液相色譜圖

3.1.2 流動相比例

確定流動相的組成后，用山梨酸鉀標準品制成質量濃度為0.04 mg/mL 的山梨酸鉀對照品溶液，在柱溫40 ℃，進樣量20 μL，流速1 mL/min，波長262 nm 的條件下，以±5%進行流動相比例調整以達到更佳的峰形和更合適的出峰時間，發現75%∶25%已經能夠達到比較理想的效果。

不同比例的0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液與乙腈為流動相時的液相色譜圖見圖2。

圖2 不同比例的0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液與乙腈為流動相時的液相色譜圖

3.1.3 柱溫

確定流動相的組成和比例后，用山梨酸鉀標準品制成質量濃度為0.04 mg/mL 的山梨酸鉀對照品溶液，波長262 nm，流速1 mL/min，進樣量20 μL 時，分別在柱溫為40，30 ℃條件下進樣。40 ℃的峰形更加尖細，出峰時間也相較30 ℃的更合適。

3.1.4 進樣量

用山梨酸鉀標準品制成質量濃度為0.04 mg/mL的山梨酸鉀對照品溶液，固定波長262 nm，流速1 mL/min 不變，分別在進樣量為20，10 μL 的條件下進樣，記錄色譜圖。20 μL 的進樣量相較10 μL 的更加合適，峰形也比10 μL 的美觀。

3.2 方法學驗證

3.2.1 線性范圍

配制質量濃度為0.008，0.016，0.032，0.040，0.048，0.064，0.080 mg/mL 的梯度溶液，以質量濃度（X） 為橫坐標，峰面積（Y） 為縱坐標繪制標準曲線。據圖3 可知，山梨酸鉀的線性回歸方程為Y=206 812 000X+49 078，R2=0.999 8。結果說明，山梨酸鉀在質量濃度為8.136～81.360 μg/mL 內線性關系良好。

線性回歸方程見圖3。

圖3 線性回歸方程

3.2.2 專屬性驗證

專屬性驗證指的是如果樣品除了待測成分以外還存在其他成分時，如輔料、雜質、降解產物等，采用的方法可以正確地測定被測物的能力。按2.2.1的方法得到標準品儲備液，按2.2.2 的方法得到樣品（批號17092531） 溶液和陰性樣品（批號20180105）溶液對照，記錄出峰時間及峰面積。

專屬性驗證色譜圖見圖4。

圖4 專屬性驗證色譜圖

由圖4 可見，山梨酸鉀峰周圍并無雜質峰，標準品儲備液與樣品出峰時間在誤差范圍內，且同一時間陰性樣品并未出現色譜峰。證明該方法專屬于山梨酸鉀峰的檢出。

3.2.3 精密度驗證

按2.2.1 的方法得到標準品儲備液，連續在液相色譜儀中進樣6 次，記錄峰面積。精密度要在規定的條件之下，同1 份樣品多次取樣測得結果之間接近程度，經計算得出山梨酸鉀峰面積的RSD 為0.27%（n=6），表明該液相色譜儀的精密度良好，經該液相色譜儀的試驗數據真實、可靠、準確。

3.2.4 重復性驗證

按2.2.2 的方法制備樣品（批號17092531） 溶液，分別在室溫條件下放置0，1，2，4，6，8 h 后進行測定，記錄峰面積。該結果測得山梨酸鉀含量的RSD 為0.60%，表明該方法的重復性良好，多次操作結果都在誤差范圍內，該方法所得出的試驗數據真實可信。

3.2.5 穩定性驗證

按2.2.2 的方法制備樣品（批號17092531） 溶液，分別在室溫條件下放置0，1，2，4，6，8 h 后進行測定，記錄峰面積。試驗結果測得山梨酸鉀峰面積RSD 為0.52%（n=6），說明樣品溶液在8 h 內穩定性良好，在8 h 內樣品性質未發生改變，可以用于試驗操作，放置8 h 后試驗結果仍然準確可靠。

3.2.6 加樣回收率

準備9 個50 mL 容量瓶，將這9 個容量瓶分成3 組，每組3 個，分組名為“1∶0.8”“1∶1.0”“1∶1.2”；各加入已知含量的樣品（批號17092531）5 mL，再分別加入標準品儲備液，“1∶0.8”組中加入6 mL 標準品輔助液，“1∶1.0”組中加入8 mL標準品輔助液，“1∶1.2”組中加入10 mL 標準品輔助液。加入一部分水溶解，放入超聲波清洗儀中超聲溶解，超聲完畢冷卻到室溫后加水稀釋至刻度，搖勻，貼上標簽，進行測定，記錄測得的峰面積。根據線性回歸方程進行含量計算及另外進行加樣回收率的計算。加樣回收率一般用于測定方法的準確度，即該方法測定出來的結果跟參考值或者真實值接近程度，該方法中的山梨酸鉀加樣回收率為98.21%，RSD 為0.53% （n=9），說明該方法準確度良好。

3.2.7 耐用性驗證

分別改變柱溫、流動相pH 值，其他條件不變，記錄峰面積并進行計算。分別改變柱溫、流動相pH 值，其他條件不變時，測定結果不受影響，可以為建立的日常檢驗新方法提供依據。

3.3 樣品含量測定

按2.2.2 的方法制備樣品（批號18060727）、樣品（批號17092531）、樣品（批號170601），進行測定，記錄峰面積，按所得出的線性回歸方程進行含量計算。

樣品中山梨酸鉀含量測定結果見表1。

表1 樣品中山梨酸鉀含量測定結果

4 結論

研究得出最適合測定葡萄糖酸鋅口服液中山梨酸鉀含量的高效液相色譜條件為流動相0.02 mol/L，磷酸二氫鈉溶液∶乙腈（75%∶25%），柱溫40 ℃，進樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測波長262 nm。該方法靈敏度高、可信度高、操作簡便，目前我國尚未有明確的山梨酸鉀添加在藥品中的限量標準，因此研究可以為葡萄糖酸鋅口服液中山梨酸鉀的含量檢測提供參考。