酶比色法和雷氏鹽分光光度法在測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中膽堿含量的比較

梁喜玲

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048）

0 引言

膽堿（Choline），又名膽素，是一種含氮的有機(jī)堿性化合物，1849 年首次從豬肝中被分離出來(lái)，化學(xué)名稱(chēng)為β - 羥乙基- 三甲胺，分子式為C5H15NO2。在維持正常的人體機(jī)能方面膽堿及其衍生物有著極其重要的作用[1]。通常情況下在生物有機(jī)體內(nèi)以游離態(tài)膽堿、乙酰膽堿、卵磷脂或鞘磷脂等形式存在，一旦缺乏可能會(huì)引起干細(xì)胞受損、腎臟損害、記憶力損傷及引起心腦血管等一系列疾病[2-3]。目前，對(duì)于人體缺乏膽堿所受影響的相關(guān)研究較多, 雖然人體缺乏膽堿會(huì)帶來(lái)相關(guān)疾病，但攝入量只需滿足機(jī)體需求即可, 無(wú)需過(guò)量攝入。膽堿及其衍生物是一種重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，人體在肝臟中可以合成膽堿，但人體自然合成的膽堿不足以滿足人類(lèi)的正常需要，因此從食物中攝取大部分膽堿是很有必要的[4]。人類(lèi)必須從飲食中獲得一定量的膽堿，尤其是一些特殊人群，如孕產(chǎn)婦，除正常的飲食攝取外，可適當(dāng)補(bǔ)充一些添加了膽堿的特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，膽堿的主要化合物來(lái)源有氯化膽堿和酒石酸氫膽堿2種形式。

以特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中膽堿的測(cè)定為例，對(duì)酶比色法和雷氏鹽分光光度法[5]進(jìn)行比較，研究建立快速準(zhǔn)確的膽堿類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)方法，對(duì)于一些特殊醫(yī)學(xué)用途的配方食品具有重要意義，同時(shí)對(duì)食品檢測(cè)人員更好地開(kāi)展膽堿檢測(cè)工作提供參考。

1 試劑與儀器

1.1 樣本與試劑

2 個(gè)批次的孕產(chǎn)婦營(yíng)養(yǎng)配方谷粉，樣本由企業(yè)提供；質(zhì)控樣，中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供。

膽堿酒石酸氫鹽標(biāo)準(zhǔn)品；磷脂酶D、膽堿氧化酶和過(guò)氧化物酶，美國(guó)Sigma 公司提供，酶的保存需要注意其保存條件；酶比色法和雷氏鹽分光光度法中的其他常規(guī)試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。常規(guī)試劑的配制完全依照GB 5413.20—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測(cè)定》中的方法進(jìn)行。

1.2 儀器與設(shè)備

層析柱、250 mL 磨口錐形瓶及回流裝置、電熱恒溫水浴鍋、ATL-224 型電子天平、T9CS 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣本的前處理

2 種測(cè)定方法中樣本的前處理過(guò)程完全參照國(guó)標(biāo)GB 5413.20—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測(cè)定》中的方法進(jìn)行。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

酶比色法中的膽堿氫氧化物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度2.5 mg/mL）、膽堿氫氧化物標(biāo)準(zhǔn)工作液（質(zhì)量濃度250 μg/mL）、雷氏鹽分光廣度法中的膽堿酒石酸氫鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 g/L） 的配制均參照國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行。膽堿酒石酸氫鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液需保存在4±2 ℃冰箱中，且勿超過(guò)1 周。

1.3.3 發(fā)色劑配制

取苯酚50 mg、4 - 氨基安替比林15 mg、膽堿氧化酶（100～120 活力單位） 10～15 mg、過(guò)氧化物酶（250～280 活力單位） 1.95～2.35 mg 和磷脂酶D（75～100 個(gè)活力單位） 1.80～ 2.00 mg 放置于100 mL的容量瓶中，用Tris 緩沖溶液（0.05 mol/L） 稀釋到刻度線，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 精密度試驗(yàn)

選擇樣本1 孕產(chǎn)婦營(yíng)養(yǎng)配方谷粉作為精密度測(cè)試的研究對(duì)象。分別稱(chēng)取1 號(hào)樣本12 份，在相同的試驗(yàn)條件下，用酶比色法平行測(cè)定6 份產(chǎn)品中的膽堿含量，另外6 份用雷氏鹽分光廣度法測(cè)其膽堿含量，研究2 種方法的精密度情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用常用軟件Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 步驟分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 酶比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)備6 支試管，分別做好標(biāo)記，管A 作為試劑空白管，其余5 支由1～5 編號(hào)備用。按照GB 5413.20—2013 中的方法，分別移取一定體積的膽堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（2，4，6，8 mL） 用蒸餾水定容于10 mL容量瓶。參照表1 中的試劑添加量，加入不同梯度的試劑，然后按照GB 5413.20—2013 中的方法進(jìn)行處理。加入發(fā)色劑后，蓋塞密封、混勻，然后將所有試管放置于37 ℃的恒溫水浴中保溫反應(yīng)15 min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時(shí)的試劑添加量見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時(shí)的試劑添加量

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.20—2013 中膽堿的測(cè)定方法，將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（μg/mL），縱坐標(biāo)為相應(yīng)的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=0.003 0X+0.021 8，R2=0.999 5，線性良好。

酶比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 酶比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.1.2 雷氏鹽分光光廣度法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將層析柱與滴頭用乳膠管連接，層析柱的底部用脫脂棉堵住，添加大約5 cm 高的弗羅里硅土，用甲醇提前浸濕，備用。分別移取一定體積膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液（0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL） 于層析柱中，待標(biāo)準(zhǔn)溶液完全進(jìn)入層析柱后，依次用5 mL 和10 mL甲醇，20 mL 乙酸甲酯洗滌，再加入雷納克銨鹽溶液5 mL，過(guò)量的雷納克銨鹽用適量的冰乙酸洗滌除去，直至層析柱呈現(xiàn)硅土原有的白色。粉紅色的膽堿雷納克銨鹽用丙酮洗脫，用10 mL 的容量瓶收集并定容，若洗脫液混濁則需用0.45 μm 的濾膜過(guò)濾，備用。選定波長(zhǎng)526 nm 測(cè)定濾液的吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為膽堿酒石酸氫鹽含量（mg），縱坐標(biāo)為相應(yīng)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，所擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=0.038 9X+0.001 1，R2=0.999 2，線性較好。

雷氏鹽分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 雷氏鹽分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 試樣的測(cè)定

樣本的測(cè)定中，酶比色法按照表2 所示的試劑添加量進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)試樣分別準(zhǔn)備（B、C） 2 支試管。在做標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的同時(shí)，樣本也參照方法同時(shí)進(jìn)行。

樣本測(cè)定時(shí)的試劑添加量見(jiàn)表2。

表2 樣本測(cè)定時(shí)的試劑添加量

雷氏鹽分光光度法中移取10 mL 試樣水解液于層析柱中，其余方法均同于2.1.2 中的方法進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1 測(cè)定結(jié)果

在相同的條件下，將質(zhì)控樣和2 個(gè)批次的孕產(chǎn)婦營(yíng)養(yǎng)配方谷粉總計(jì)3 個(gè)樣本分別用酶比色法和雷氏鹽分光光度法進(jìn)行測(cè)定，2 種方法測(cè)定的樣本和質(zhì)控樣的膽堿含量差值均較小。對(duì)質(zhì)控樣的膽堿含量測(cè)定后，與其理論值117.5 mg/100 g 進(jìn)行比對(duì)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。

2 種方法檢測(cè)質(zhì)控樣與2 個(gè)樣本的膽堿結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 2 種方法檢測(cè)質(zhì)控樣與2 個(gè)樣本的膽堿結(jié)果

3.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

用酶比色法對(duì)1 號(hào)樣本平行測(cè)定6 次，膽堿含量的平均值為156.2 mg/100 g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.41%；用雷氏鹽分光廣度法測(cè)定6 次平行試驗(yàn)的結(jié)果為154.6 mg/100 g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.42%，表明2 種膽堿測(cè)定方法的精密度較好，且2 種方法測(cè)定結(jié)果相差不大，可以滿足檢測(cè)要求。

1 號(hào)樣本精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 1 號(hào)樣本精密度試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

在已探究酶比色法測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中膽堿含量方法適用性基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)樣本與質(zhì)控樣中膽堿含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，酶比色法和雷氏鹽分光光度法的測(cè)試結(jié)果較為相近，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合與精密度試驗(yàn)均能滿足檢測(cè)的要求。酶比色法的專(zhuān)屬性較強(qiáng)且重復(fù)性較好，操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)單容易，但檢出限及酶的價(jià)格相對(duì)較高，考慮到成本消耗其使用面就受到一定程度的限制；而雷氏鹽分光光度法則需要用到層析柱，前處理較為繁雜且耗時(shí)長(zhǎng)、樣品易損失，但對(duì)設(shè)備要求不高，成本相對(duì)低廉，故而在工作中應(yīng)該綜合考慮，結(jié)合實(shí)際情況選擇合適的檢測(cè)方法。