大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立*

馬秀蘭，王秀萍，王佳林，王藝臻，朱西杰，2

1 寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 寧夏銀川 750004

2 寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院 寧夏銀川 750004

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）為結(jié)腸癌前病變和臨床難治病，是一種主要累及直腸、結(jié)腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎癥[1]，屬于炎癥性腸病（IBD）范疇，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便[2]。UC的病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，而潰瘍性結(jié)腸炎動物模型是研究潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生機(jī)制和評價相關(guān)藥物效果的必不可少的工具，故對UC模型制備方法的研究具有重要的意義。近些年，隨著研究的深入，關(guān)于UC模型的制備，有藥物法、免疫法、中藥法等，但TNBS誘導(dǎo)的UC模型是公認(rèn)的，有著造模成功率高，造模周期短的優(yōu)點(diǎn)[3]。本課題組在前期研究中，積累了一定經(jīng)驗。因此，TNBS可作為潰瘍性結(jié)腸炎模型的制備誘導(dǎo)劑。本研究對TNBS的造模方法進(jìn)一步探討，驗證了其造模時間短、陽性率高、操作簡便。

TNBS模型能夠很好地模擬潰瘍性結(jié)腸炎的慢性復(fù)發(fā)過程，癥狀和組織學(xué)改變與人類UC相似，其模型呈慢性炎癥變化，病程長，穩(wěn)定性好[17]。研究發(fā)現(xiàn)，實驗的最佳造模劑量為100～150mg/kg[18]，一次性直腸給藥即可，發(fā)生的炎癥可維持7～8周，急慢性期分界約在3周，可明確的控制。TNBS引起IL-12介導(dǎo)的Th1細(xì)胞免疫性反應(yīng)，且TNF-α、IFN-γ含量增高[19]。該模型制備過程中，簡單易行、重復(fù)性好、造模時間短，并且經(jīng)濟(jì)實用，適合于對防治藥物的篩選和研究，符合本實驗后期的研究[20]。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠120只，雄性，體質(zhì)量150～220g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心屏障，許可證號SCXK（寧）2020-0001。

1.2 實驗試劑 ①10%水合氯醛；②2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitro-benzene sulfonicacid，TNBS）；③無水乙醇；④4%多聚甲醛，購買自上海尚寶生物科技有限公司；⑥尿糞便隱血定性檢測試劑盒（購買自信帆生物技術(shù)有限公司）等。

2 實驗方法

2.1 試劑配置 50%乙醇：用蒸餾水稀釋無水乙醇至50%，4℃保存；TNBS-50%乙醇混合溶液：將5%TNBS溶液與50%乙醇溶液等按2：1體積混合，4℃保存待用。

2.2 模型制備 采用TNBS灌腸法制備潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，大鼠造模前禁食不禁水36h。隨機(jī)留取8只動物作為空白對照組，其余大鼠10%水合氯醛（0.4mL/100g）腹腔注射麻醉后，使用硅膠管蘸取30%甘油潤滑，輕插入肛門約8cm，150mg/kg（0.45mL/100g）注入 5%TNBS+50% 乙醇[21]（2： 1體積）混合液，然后捏緊肛門提尾倒放3min后，放回籠中，采用頭低腳高位30～60°，充分保暖，自然蘇醒，常規(guī)飼養(yǎng)[22-23]。

結(jié) 果

1 疾病活動指數(shù)（DAI）評分

造模后觀察大鼠每日腹瀉、血便及體重情況，記錄大鼠的一般情況[24]。日常觀察：精神萎靡，懶于活動，大鼠飲食飲水量明顯減少，體重明顯下降，消瘦，出現(xiàn)身體蜷縮，毛發(fā)豎立，行動遲緩（見圖1）；大便稀溏，肛周污穢（見圖2）；大便次數(shù)明顯增多，軟便或稀便（見圖3）；大便末端有黏液或膿點(diǎn)，便血（見圖4）等表現(xiàn)。DAI評分：造模3d后，綜合大鼠體重下降百分率（體重不變?yōu)?0；1～ 5為 1分；6～ 10為 2分；11～15為3分；大于15為4分），糞便性狀（正常為0；半稀便為1分；稀便為3分）和便血（隱血陰性為0分；隱血陽性為1分；肉眼血便3分）進(jìn)行評分。DAI[25]＝（體重下降分?jǐn)?shù)＋糞便性狀分?jǐn)?shù)＋隱血分?jǐn)?shù)）/3，體重下降5%計分為1分。DAI綜合評分介于0～4分，0分代表正常，4分代表炎癥最大活動度。

圖1

圖2

圖3

圖4

造模3d后，殺檢驗證造模成功后，隨機(jī)抽取10只模型大鼠，進(jìn)行DAI的計算，造模效果顯著，為后續(xù)試驗的開展奠定基礎(chǔ)。見表1。

表1 造模后隨機(jī)大鼠DAI分?jǐn)?shù)分析

2 黏膜組織學(xué)評分

觀察結(jié)腸黏膜組織的病理學(xué)變化，并對炎癥損傷進(jìn)行大體形態(tài)評分。取距肛門8cm的結(jié)腸組織（見圖5），沿縱軸切開，冷生理鹽水洗凈，稱重計算結(jié)腸指數(shù)；平鋪固定，觀察大體形態(tài)，用1mm2的網(wǎng)格紙測量出潰瘍面積，計算潰瘍指數(shù)。評分標(biāo)準(zhǔn)[25]：黏膜無損傷，0分；局部充血水腫但沒有糜爛，潰瘍形成，1分；有線性潰瘍形成但沒有明顯炎癥，2分；有潰瘍，且僅有一處出現(xiàn)炎癥，3分；沿結(jié)腸長軸兩個或以上部位有潰瘍形成和炎癥，但潰瘍﹤1cm，4分；有多處潰瘍和嚴(yán)癥，且潰瘍和炎癥沿結(jié)腸縱軸超過1cm，5分。

圖5 結(jié)腸黏膜肉眼可見潰瘍、血痂

3 組織形態(tài)學(xué)觀察

取病變最明顯結(jié)腸段長度約1cm，4%多聚甲醛溶液固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。肉眼可見病變結(jié)腸水腫，腸壁增厚，腸道黏膜有大小不定的潰瘍面。鏡下可見結(jié)腸黏膜糜爛、潰瘍、隱窩膿腫、杯狀細(xì)胞消失，固有層中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，壞死灶周邊上皮充血，間質(zhì)層有嗜中性、嗜酸性粒細(xì)胞和炎細(xì)胞浸潤，黏膜下層結(jié)締組織增生，有大量炎細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞為主[26-27]。見圖6。

圖6 結(jié)腸切片

4 鄰聯(lián)甲苯胺法檢測大便潛血

血紅蛋白具有過氧化物酶樣作用，以催化H2O2作為電子受體使色原鄰聯(lián)甲苯胺氧化呈鄰偶氮苯甲而顯藍(lán)色，其顏色深淺與血紅蛋白含量成正比，又稱糞便隱血實驗。用竹簽挑取少量糞便，放入24孔板中。然后依次滴加O-tolidine solution2～3滴。混勻后再加入2～3滴配置好的氧化劑，混勻后，立即觀察顏色變化。2min內(nèi)有藍(lán)色出現(xiàn)，提示糞便含有血紅蛋白（Hb）或糞便隱血實驗陽性。陰性：2min內(nèi)不顯色；陽性（+）：10s后淺藍(lán)色漸變?yōu)樗{(lán)色；陽性（2+）：加入試劑后初顯淺藍(lán)色，逐漸呈明顯藍(lán)褐色；陽性（3+）：加入試劑后立即呈現(xiàn)藍(lán)褐色；陽性（4+）：加入試劑后立即呈現(xiàn)藍(lán)黑褐色。見圖7。

圖7 （左邊為10s顯色，右邊為2min顯色）

討 論

迄今，已經(jīng)提出了多種潰瘍性結(jié)腸炎動物模型的制備方法，但廣泛使用的是TNBS誘導(dǎo)的UC模型。該造模方法使用TNBS和50%乙醇混合液，利用50%乙醇損壞腸道黏膜屏障，使蛋白裸露，TNBS直接作用于腸黏膜，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[28]。本實驗發(fā)現(xiàn)，3d左右大鼠均有UC癥狀出現(xiàn)，或精神萎靡，或稀便，或黏液血便，或體重明顯下降，或均可見；病檢可見：結(jié)腸黏膜糜爛、潰瘍、隱窩膿腫，大量炎細(xì)胞浸潤等。該造模方法具有時間短、動物耐受性好的優(yōu)點(diǎn)，且該法采用灌腸，藥物直接作用于腸道，造模成功率高，易操作，易于推廣[29]。在模型制備過程中，可通過糞便形態(tài)和大鼠體重的監(jiān)測，明確腸道炎癥的輕重和病情的變化。通過對近年來國內(nèi)外關(guān)于潰瘍性結(jié)腸炎模型動物的選擇（如年齡、體重）、造模方法進(jìn)行歸納總結(jié)及比較，自身采用TNBS法，成功制備潰瘍性結(jié)腸炎模型，旨在為潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制研究及新藥開發(fā)提供有益參考。

1 潰瘍性結(jié)腸炎模型制備

1.1 三硝基苯磺酸（TNBS）模型 TNBS是一種有機(jī)酸半抗原，和乙醇配比成混合物，利用乙醇損害屏障功能，使得TNBS向腸壁滲透，使得裸露的蛋白與TNBS結(jié)合形成自身抗原，造成機(jī)體以Th反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)，形成以腸壁潰瘍、增厚、狹窄、肉芽腫為特征的節(jié)段分布的透壁性炎癥，結(jié)腸上皮黏膜出現(xiàn)慢性期淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞浸潤[4]。

1.2 惡唑酮（OXZ）模型[5-6]惡唑酮多采取直腸給藥，可引起嚴(yán)重的結(jié)腸炎。惡唑酮制備的小鼠結(jié)腸炎病變位于遠(yuǎn)端結(jié)腸，主要作用于黏膜和黏膜下層，主要表現(xiàn)為：大便次數(shù)增多、稀便、便上有黏液或膿點(diǎn)，肛周有糞便粘連等，或可見黏液血便，腹腔內(nèi)可見大量腹水，結(jié)直腸水腫擴(kuò)張、腸壁顏色變暗，變薄，形成偽膜，腸道黏膜充血水腫、糜爛和淺潰瘍形成；黏膜下水腫、杯狀細(xì)胞和腺體減少，固有層有彌漫性中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，黏膜下淋巴細(xì)胞增生[7]。

1.3 葡聚糖硫酸鈉（DSS）模型[8]DSS是一種水溶性硫酸多糖體，可損傷腸上皮，致使固有層和黏膜下層直接與腸道細(xì)菌和抗原接觸，從而引發(fā)炎癥；DSS可直破壞腸道屏障完整性，改變結(jié)腸黏液層菌群變化，致使腸內(nèi)細(xì)菌損傷上皮細(xì)胞，使結(jié)腸緊密連接蛋白和緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、Zo-1表達(dá)下降、結(jié)腸黏膜屏障緊密性降低和腸道菌群失調(diào)，從而導(dǎo)致急性結(jié)腸炎的發(fā)生[9]。模型表現(xiàn)為：體重減輕，直腸出血、血性腹瀉、潰瘍、粒細(xì)胞浸潤、上皮細(xì)胞喪失和嗜中性粒細(xì)胞浸潤[10]。優(yōu)點(diǎn)：DSS采用直接飲用的方式，故劑量及時間易控，可制備急、慢性結(jié)腸炎便于研究；缺點(diǎn)：建模周期長，費(fèi)用高、耗時長，模型動物致死率高。其UC模型制備操作簡單，但DSS液濃度的把控是模型成功與否的關(guān)鍵，研究中多用的是體積為3%或者4%的DSS液，最適濃度還待研究[11-12]。

1.4 2，4-二硝基氯苯和醋酸復(fù)合法[13]DNCB是一個半抗原，與組織蛋白結(jié)合可激發(fā)T淋巴細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)，誘發(fā)大鼠發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，該混合溶液灌腸破壞結(jié)腸黏膜屏障，產(chǎn)生炎癥，建立大鼠UC模型[14]。該方法優(yōu)點(diǎn)如下：病理學(xué)變化符合UC特征，可根據(jù)模型鼠的表現(xiàn)，按照時間分為潰瘍期：8周內(nèi)均可見結(jié)腸黏膜充血水腫，明顯的潰瘍形成及全層性炎癥細(xì)胞浸潤和隱窩膿腫形成；潰瘍愈合期：6周后黏膜充血水腫減輕，中性粒細(xì)胞浸潤消失，以淋巴細(xì)胞為主[15]。此方法UC模型可維持16周以上，克服了單純DNCB法病程短、自愈性強(qiáng)的弱點(diǎn)，為觀察藥物療效提供了有利的條件。此方法易復(fù)制，操作簡單，模型動物的存活率較高，但易自愈[16]。

2 麻醉藥物的影響

水合氯醛是無色透明的白色結(jié)晶，味微苦，有特殊臭味，易潮解，在空氣中徐徐揮發(fā)，易溶于水、醇、氯仿和乙醚。不耐高熱，宜密封避光保存于陰涼處。本品對呼吸有一定抑制作用，大劑量則抑制延髓的呼吸中樞和血管運(yùn)動中樞，出現(xiàn)呼吸抑制，血壓下降。故本品的保存和使用都需要特別注意。①臨用前現(xiàn)配制，不可久存，防止分解，剩余的藥液應(yīng)棄用。②靜脈注射時，絕不可將藥液漏出血管之外的周圍組織；配用濃度：用生理鹽水配制時不超過10%，醇溶液不超過5%。濃度過高時，會發(fā)生溶血作用。③水合氯醛的劑量控制不佳，或注射部位過深，損傷腸道，均可能引起腸梗阻的發(fā)生；水合氯醛麻醉后，動物容易腹脹而死，考慮為濃度過高引起，給藥原則是一次性給齊，切記多次給藥，否則腹脹發(fā)生率明顯增高。④本品深麻醉劑量和致死劑量接近，故實驗前，應(yīng)至少禁食24h，保證動物體重處于一個穩(wěn)定水平，根據(jù)造模當(dāng)天的體重精確計算麻醉劑量。⑤水合氯醛能降低新陳代謝，抑制體溫中樞，故在深麻醉時，可顯著降低體溫，因此麻醉時及麻醉后都要注意保暖，給予動物毛巾蓋被或置于厚而柔軟的毛巾上，進(jìn)行操作，尤其冬天。

3 實驗改進(jìn)

3.1 麻醉藥物使用 實驗過程中廣泛使用的麻醉藥物水合氯醛[30]，存在藥物的濃度和劑量較難控制，對動物的刺激性大，動物死亡率高的缺點(diǎn)，為避免此缺點(diǎn)，實驗操作過程中，嚴(yán)格掌握藥物劑量，按照禁食后造模當(dāng)天大鼠體重進(jìn)行計算，現(xiàn)配現(xiàn)用，腹腔注射時，與助手相互配合，采取倒置姿勢，防止針尖傷及腹腔臟器，嚴(yán)格按照腹腔注射方法開展。

3.2 灌腸操作 TNBS灌腸傳統(tǒng)器材為硅膠管，灌腸過程中，灌腸液容易溢出，且灌液后拔出時，易帶出液體，影響造模效果及模型的穩(wěn)定性；操作過程中，選用較硬的塑料管，用石蠟油潤滑，便于插入腸道，灌液后，提尾倒置3min，并采取頭低腳高位，使藥液充分留在腸道內(nèi)，使得模型穩(wěn)定性高。

3.3 動物和造模藥物選擇 大鼠壽命約2.5～3年，正常飼養(yǎng)大鼠，6～8周齡，體重達(dá)180～220g，10周齡后體重達(dá)400g趨于穩(wěn)定，選用體質(zhì)量180～220g的SD大鼠，該時期腸道對TNBS的敏感性較強(qiáng)，灌腸后，3d即可出現(xiàn)典型的潰瘍性結(jié)腸炎癥狀，節(jié)省造模時間，對于TNBS的灌腸濃度也進(jìn)行改進(jìn)，予以5%TNBS+50%乙醇（2：1體積混合）混合液灌腸1次即可，造模效率高，癥狀典型，造模時間短[31]。

3.4 造模時間 小鼠禁食24h后仍可能有糞便堆積于結(jié)腸處，將禁食時間延長至36h，則結(jié)腸處糞便排空比較完全，造模時，大鼠糞便明顯較少，藥液流出減少。

動物模型的成功制備，是后續(xù)實驗開展的基礎(chǔ)。TNBS制備的潰瘍性結(jié)腸炎模型，能客觀的反映人體臨床UC病癥，但同時存在許多的不足，如模型表現(xiàn)單一，模型自愈能力較強(qiáng)等。如何解決模型的維持問題，是動物實驗及后續(xù)實驗開展的重中之重，也是廣大學(xué)者的研究熱點(diǎn)。根據(jù)自己的實驗操作，進(jìn)行簡要介紹，以期對同類研究有借鑒作用。