基于能量代謝的巴戟天鹽、酒炙炮制增效作用對(duì)比研究*

吳文輝，管莉，魏玉玲，賈琳，曾敏

重慶市中醫(yī)院 重慶 400021

巴戟天為茜草科巴戟天屬植物巴戟天Morinda officinalis How.的干燥根，味甘、辛，性微溫，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)，祛風(fēng)除濕的功效。本品不僅補(bǔ)腎助陽(yáng)，還強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕，對(duì)腎陽(yáng)虛兼風(fēng)濕之證尤宜，且甘潤(rùn)而不燥。現(xiàn)代炮制應(yīng)用多以巴戟肉、鹽巴戟和制巴戟為主，認(rèn)為生品味辛而溫，補(bǔ)肝腎祛風(fēng)濕力強(qiáng)，適用于腎虛而兼有風(fēng)濕之證；鹽炙后功專入腎，增強(qiáng)補(bǔ)腎助陽(yáng)的作用，適用于腎中元陽(yáng)不足的陽(yáng)痿早泄，宮冷不孕等；甘草制后味甘，補(bǔ)腎益氣養(yǎng)血，適用于脾腎虧損，氣血不足等，而酒炙則甚少應(yīng)用[1]。但是，巴戟天酒炙炮制歷史沿革卻顯示，巴戟天酒制（炙）在古代，不僅常用于祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)，亦曾廣泛用于溫腎助陽(yáng)，以治療腎虛陽(yáng)痿及不孕等癥[2]。中醫(yī)腎陽(yáng)虛，是腎陽(yáng)虛衰，溫煦失職，氣化失權(quán)所表現(xiàn)的一類虛寒證候，患者常有畏寒怕冷，四肢發(fā)涼（重者夏天也涼），腰背冷痛，遇寒則甚，遇熱則緩等臨床表現(xiàn)。而輔料酒味辛、甘，性大熱，辛甘化陽(yáng)，熱者益熱。因此，巴戟天酒炙亦有可能同時(shí)具有溫腎助陽(yáng)的炮制增效作用。本研究擬從能量代謝的角度為切入點(diǎn)，對(duì)比研究巴戟天酒炙與鹽炙對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠模型能量代謝的影響，為巴戟天酒炙溫腎助陽(yáng)的科學(xué)闡釋提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體重220～260g，SPF級(jí)，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。

2 實(shí)驗(yàn)儀器

HYC-310S醫(yī)用冷藏箱（海爾）、Synergy HTX全波段酶標(biāo)儀（Bio-teck）、超低溫冰箱（Thermo）、TGL-18C-C臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭）、RT-3100C全自動(dòng)洗板機(jī)（雷杜生命科技有限公司）、AXLM1820-2超純水機(jī)（阿修羅）、UV-2450紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）。

3 實(shí)驗(yàn)材料

巴戟天購(gòu)買于重慶桐君閣股份有限公司，經(jīng)重慶市中醫(yī)研究院中藥制劑研究所副所長(zhǎng)楊敏主任中藥師鑒定為茜草科植物巴戟天Morinda officinalisHow的干燥根。右歸丸（小蜜丸，仲景宛西制藥股份有限公司，批號(hào)：180901）。注射用氫化可的松琥珀酸鈉（50mg×5支，天津生物化學(xué)制藥有限公司，批號(hào)：011909022）。氯化鈉注射液（500ml：4.5g，太極西南藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20084002）。Na＋-K＋-ATP酶、Ca2＋-Mg2＋-ATP酶、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、大鼠乳酸脫氫酶（LDH）和考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)自江蘇晶美生物科技有限公司，批號(hào)202011。

巴戟天生品：取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，置蒸制容器內(nèi)蒸透，趁熱除去木心，或用水潤(rùn)透后除去木心，切段，干燥。篩去碎屑。鹽巴戟天：取凈巴戟段，用鹽水拌勻，待鹽水被吸盡后，置炒制容器內(nèi)，用文火炒干。巴戟天每100kg用食鹽2kg。酒巴戟天：取凈巴戟段，用適量黃酒拌勻，悶潤(rùn)，待酒被吸盡后，置炒制容器內(nèi)，用文火炒干。巴戟天每100kg用黃酒10kg。

4 供試品制備

4.1 右歸丸陽(yáng)性對(duì)照液制備 右歸丸粉碎，臨用時(shí)用0.5%羧甲基纖維素鈉配置成2776.50mg/ml右歸丸液（相當(dāng)于成人日服劑量10倍）[3-7]；

4.2 巴戟天（生品、鹽炙品、酒炙品）供試品制備 巴戟天（生品、鹽炙品、酒炙品）剪碎，75%乙醇回流提取兩次，每次10倍量，每次提取1h，后藥渣水回流提取2次，每次10倍量，每次提取1h，合并4次提取液減壓濃縮至無醇味，0.5%羧甲基纖維素鈉分別配置成低劑量102.83 mg生藥/mL（相當(dāng)于成人最大日用劑量10g）、中劑量3084.90mg生藥/ml（相當(dāng)于成人最大日用劑量10g的30倍）、高劑量6169.80mg生藥/mL（相當(dāng)于成人日服劑量10g的60倍）混懸液。

4.3 氫化可的松琥珀酸鈉注射液 注射用氫化可的松琥珀酸鈉臨用前用生理鹽水配置成25mg/ml

5 方法

5.1 分組及給藥 SD大鼠，雄性，體重220～260g，SPF級(jí)，54只，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性組、生品（低、中、高）組、鹽炙（低、中、高）組，酒炙（低、中、高）組，每組8只。除空白組和模型組灌胃給與等量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液外，其余各組灌胃給與相對(duì)應(yīng)的藥物，1次/d，給藥劑量為1mL/100g，給藥前禁食不禁水 12h，持續(xù) 25d。

5.2 造模 給藥第3天開始造模，除空白組給與等量生理鹽水外，其余各組肌肉注射氫化可的松琥珀酸鈉注射液 0.1mL/100g，1 次 /d，持續(xù) 20d[8]。

5.3 血清采集及測(cè)定 末次給藥2h后，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血，離心，取血清，按試劑盒要求進(jìn)行測(cè)定，或-80℃保存，備用。

5.4 肝組織取樣、勻漿及蛋白濃度測(cè)定[9-11]上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采血后，迅速摘取同一部位肝組織，冷生理鹽水快速洗凈，濾紙拭干，精確稱量，按照質(zhì)量（g）：體積（ml）為1∶9的比例，冰層上制成肝組織勻漿，2500r/min離心10min，取上清液按照試劑盒說明書測(cè)定 Na＋-K＋-ATP酶、Ca2＋-Mg2＋-ATP酶、SDH 和LDH。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白總量。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)均以（）表示

結(jié) 果

1 巴戟天酒炙和鹽炙對(duì)腎陽(yáng)虛肝組織中能量代謝相關(guān)酶的影響

與空白組正常值比較，模型組大鼠肝組織中Na＋-K＋-ATP酶、Ca2＋-Mg2＋-ATP酶、SDH 和 LDH活性均有顯著的下降（P＜0.01）。給藥干預(yù)后，相較于模型組，生品組雖無顯著差異，但趨勢(shì)明顯。鹽炙組在中劑量和高劑量上表現(xiàn)出顯著的改善作用，具體為中劑量組可顯著升高Na＋-K＋-ATP酶（P＜0.05）和Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶活性（P＜0.01），高劑量組 4種酶的活性均能得到顯著升高（P＜0.05）。酒炙組較鹽炙組改善作用則更加明顯，中劑量組和高劑量組均能顯著提升4種酶的活性（P＜0.05），且在Ca2＋-Mg2＋-ATP酶活性和LDH的提升上極為顯著（P＜0.01）.相同劑量下，鹽炙組與酒炙組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，但提升率高于鹽炙組。見表1。

表1 巴戟天酒炙前后對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠肝組織中能量代謝相關(guān)酶的影響（n=8，）

表1 巴戟天酒炙前后對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠肝組織中能量代謝相關(guān)酶的影響（n=8，）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

LDH/U·mgprot-1空白組 - 1.646±0.363 1.725±0.182 8.972±1.223 3466.0981±473.189模型組 - 0.944±0.274** 0.917±0.209** 5.613±0.853** 1976.564±327.823**陽(yáng)性組 2776.50 1.467±0.186## 1.601±0.231## 7.917±1.159## 3069.571±361.189##生低組 102.83 1.005±0.239 1.069±0.189 5.771±1.117 2291.427±346.317生中組 3084.90 1.092±0.238 1.135±0.171 5.401±1.261 2327.883±389.502生高組 6169.80 1.025±0.174 1.167±0.255 6.300±1.172 2238.320±576.081鹽低組 102.83 1.110±0.212 1.119±0.262 6.434±0.951 2352.688±252.851鹽中組 3084.90 1.253±0.185# 1.286±0.168## 6.944±1.015 2424.429±392.348鹽高組 6169.80 1.292±0.269# 1.258±0.285# 7.117±1.082# 2575.032±267.076#酒低組 102.83 1.099±0.2501 1.164±0.213 6.507±0.973 2317.112±268.890酒中組 3084.90 1.383±0.299# 1.370±0.252## 7.070±1.266# 2521.817±279.903#酒高組 6169.80 1.347±0.211# 1.352±0.253## 7.343±1.176# 2712.398±541.225##組別 生藥劑量/mg·mL-1 Na＋-K＋-ATP酶/U·mgprot-1 Ca2＋-Mg2＋-ATP酶/U·mgprot-1 SDH/U·mgprot-1

2 巴戟天酒炙和鹽炙對(duì)腎陽(yáng)虛肝血液中能量代謝相關(guān)物質(zhì)的影響

與空白組正常值比較，模型組大鼠血清TC和GLU含量均有顯著的下降（P＜0.01），TG含量有顯著的升高（P＜0.01）。給藥干預(yù)后，相較于模型組，生品組雖在統(tǒng)計(jì)學(xué)上未能有顯著改善，但是各項(xiàng)指標(biāo)水平值較模型組有恢復(fù)的趨勢(shì)；鹽炙中劑量組能顯著降低TG含量（P＜0.05），高劑量組對(duì)3個(gè)指標(biāo)均能呈現(xiàn)顯著的改善作用（P＜0.05）；酒炙中劑量組能顯著升高TC水平值（P＜0.05），高劑量組亦是能3個(gè)指標(biāo)均顯著改善（P＜0.05），并且對(duì)TC水平值得恢復(fù)還具有極顯著作用（P＜0.01）。相同劑量下，鹽炙組和酒炙組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，且水平值改善率大致相當(dāng)。見表2。

表2 巴戟天酒炙前后對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠肝血液中能量代謝相關(guān)物質(zhì)的影響（n=8，）

表2 巴戟天酒炙前后對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠肝血液中能量代謝相關(guān)物質(zhì)的影響（n=8，）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 生藥劑量 /mg·ml-1 TC/mmol·L-1 TG/mmol·L-1 GLU/mmol·L-1空白組 - 1.508±0.077 0.682±0.133 4.726±0.849模型組 - 1.262±0.090** 0.963±0.152** 2.880±0.823**陽(yáng)性組 2776.50 1.435±0.059## 0.609±0.134## 4.199±0.834#生低組 102.83 1.264±0.074 0.863±0.166 3.350±0.775生中組 3084.90 1.270±0.065 0.840±0.226 2.735±1.033生高組 6169.80 1.332±0.031 0.892±0.166 3.303±1.003鹽低組 102.83 1.316±0.050 0.807±0.134 3.098±1.001鹽中組 3084.90 1.346±0.091 0.741±0.147# 2.928±0.716鹽高組 6169.80 1.385±0.049# 0.752±0.179# 4.035±1.322#酒低組 102.83 1.303±0.105 0.856±0.097 3.230±0.913酒中組 3084.90 1.363±0.46# 0.816±0.146 3.879±0.896酒高組 6169.80 1.387±0.103## 0.711±0.141# 4.065±0.544#

結(jié)論與討論

巴戟天生品雖對(duì)模型組大鼠肝組織中能量代謝相關(guān)酶和血液中能量代謝相關(guān)物質(zhì)水平值改善無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，但是作用趨勢(shì)明顯，給藥后各水平值均得到一定程度上的恢復(fù)，并且會(huì)隨著劑量得增加而得到提升，說明巴戟天本身既有改善腎陽(yáng)虛的虛寒癥狀作用。鹽炙組和酒炙組均能在一定程度上顯著恢復(fù)異常的水平值（P＜0.01或P＜0.05），說明鹽炙和酒炙均有提高巴戟天溫腎助陽(yáng)的炮制增效作用。相同劑量下，雖然酒炙組和鹽炙組的比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，但是從水平值的增長(zhǎng)率可以看出，酒炙組的提升率高于鹽炙組，且起效劑量亦有一定程度上的降低，說明在腎陽(yáng)虛的機(jī)體能量代謝上，酒炙的效果可能較鹽炙更優(yōu)。

巴戟天是臨床常用溫補(bǔ)腎陽(yáng)藥，現(xiàn)存記載最早的炮制方法為“去心”，巴戟天酒炙最早見于《雷公炮炙論》：“凡使，須用枸杞子湯浸一宿，待稍軟，漉出，卻，用酒浸一伏時(shí)，又漉出，用菊花同熬，令焦黃，去菊花，用布拭令干用”，是巴戟天除去心外最早的炮制記載。巴戟天鹽炙最早見于《太平惠民和劑局方》：“鹽湯浸打去心”。傳統(tǒng)炮制理論認(rèn)為，巴戟天心有“令人煩躁”的副作用，故應(yīng)棄去；鹽味咸，咸入腎，故鹽炙可引藥入腎經(jīng)，巴戟天鹽炙引藥歸經(jīng)，增強(qiáng)其療效；酒活血通絡(luò)，祛風(fēng)散寒，巴戟天酒炙可增強(qiáng)在治療風(fēng)濕方面的作用。但是，酒味辛、甘，性大熱，亦有熱者益熱和辛甘化陽(yáng)的作用，且中醫(yī)腎陽(yáng)虛所表現(xiàn)出的臨床證候恰為虛寒證候。因此，從理論上，酒炙也可能具有增強(qiáng)巴戟天溫腎助陽(yáng)的炮制作用。而上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了，巴戟天酒炙在腎陽(yáng)虛模型大鼠機(jī)體上的能量代謝作用不弱于鹽炙，且隱隱有優(yōu)于鹽炙的趨勢(shì)。但是在其它方面，如改善生殖能力，治療陽(yáng)痿或?qū)m冷不孕等炮制作用尚需進(jìn)一步的對(duì)比研究，以期闡明酒炙在溫腎助陽(yáng)上是否具有與鹽炙相似的炮制增效作用。