茯苓四逆湯調節TLR-4/NF-κB 通道對膿毒癥大鼠心肌抑制的保護機制研究*

黃壑霏，彭曉洪，黃亞秀，陳冬杰，黃永蓮，王評

廣東省深圳市北京中醫藥大學深圳醫院（龍崗） 廣東深圳 518172

關健詞 茯苓四逆湯；膿毒癥；TLR -4/NF-κB 信號通路；心肌抑制

膿毒癥病情兇險，一旦發生，治療難度大，死亡率高[1]。炎癥反應是膿毒癥的重要發病機制之一，也是誘發多臟器損傷的重要疾病基礎[2]。膿毒癥極易并發心肌抑制[3-4]，由此成為膿毒癥患者主要死亡原因之一[5]。膿毒癥心肌抑制發病機制尚不明確，與炎癥反應、細胞凋亡等多種因素相關。研究發現，Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR-4）通過識別脂多糖而激活單核細胞，最終活化核轉錄因子-κB（Nuclear transcription factor-κB，NF-κB）通路，使白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等表達上調，從而激活炎癥反應[6-7]。目前，膿毒癥心肌抑制無特異性治療，相關對癥治療藥物對預后的改善不明確。動物實驗證實[8-9]，多種中藥復方通過抑制炎癥反應減輕膿毒癥大鼠心肌損傷、進而改善預后。我們前期研究發現，茯苓四逆湯可以降低慢性心衰患者血清TNF-α水平[10]，減輕老年膿毒癥大鼠心肌損傷，降低死亡率[11]。本研究觀察該方對膿毒癥大鼠心肌炎癥因子表達的影響，探討其心肌保護的作用機制。

材料與方法

1 試驗動物

SPF級 SD雄性大鼠 120只，體重（210g±20）g，購自斯萊克動物研究中心（許可證號：SCXK（滬）2017-0005）。實驗開展前已通過醫院倫理委員會審查。

2 試藥與儀器

2.1 藥物 茯苓四逆湯組成：干姜8g，制附子10g，人參5g，茯苓30g，炙甘草10g，由本院中藥房提供，煎煮成含原生藥1g/mL，過濾除菌分裝4℃保存備用。參照文獻[12]計算灌胃劑量，210g大鼠等效劑量為1.3g，低、中、高劑量分別為 1.3g/d、2.6g/d、3.9g/d。

2.2 試劑 GAPDH（美國CS公司），BCA法蛋白濃度測定盒（深圳輝諾生物科技公司），磁珠法組織RNA提取試劑盒（北京天根生化公司），兔抗大鼠NF-κB抗體、兔抗大鼠心型脂肪酸結合蛋白（Heart type fatty acid binding protein，H-FABP）抗體、內參Gapdh單抗、羊抗小鼠二抗及羊抗兔二抗（Abcam，英國）。3）儀器：臺式冷凍高速離心機（美國Sorvall，Fresco D-37520型），PCR儀（美國 ABI公司，7500型），電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司，HWS28型），凝膠成像系統（上海天能，GIS2009型），蛋白電泳儀、電轉儀、雜交箱和酶標儀，均為美國Bio-Rad公司生產，移液器（美國Gilson公司），組織勻漿器（美國Pro Scientific，PRO200型）等。

3 分組與動物模型制備

3.1 分組 所有大鼠按照隨機數字表法分為6組：正常組，假手術組、模型組、中藥低、中、高劑量組，每組20只。

3.2 動物模型制備 采用盲腸結扎穿孔術 （cecal ligation and puncture，CLP）法造模。予0.4mL/kg 10%水合氯醛注射大鼠腹腔，將麻醉后大鼠固定，消毒腹部皮膚后切開劍突下2cm處腹壁，分離出盲腸，在1/3處結扎后使用21G針頭貫通擠壓出少許腸內容物，將其回納腹腔并縫合腹壁。術后予液體復蘇及復溫，單獨喂養。假手術組：開腹分離盲腸，但不結扎及穿刺，盲腸回納后關腹。正常組不做任何處理。

4 干預方法

造模成功后，大鼠正常喂養。中藥低、中、高劑量組予相應劑量茯苓四逆湯（1.3g/d，2.6g/d，3.9g/d），加生理鹽水稀釋至5ml，造模成功后6h灌胃，分兩次給藥，連續3d，正常組、假手術組、模型組同時間點予等量生理鹽水灌胃。

5 觀察指標

5.1 一般項目觀察及取材 觀察大鼠的生存狀態（精神狀態、飲食、體質量等），記錄大鼠生存時間。各組于術前及術后24h、48h、72h各取5只大鼠處死，取出新鮮心臟樣本后，用液氮速凍，-80℃保存。

5.2 心肌組織IL-6、TNF-α含量測定 心肌組織勻漿后，12000rpm離心5min，取上清，采用ELISA法檢測IL-6、TNF-α含量，操作按試劑盒（深圳輝諾生物科技公司）說明進行。

5.3 Western blott檢測 H-FABP、NF-κB蛋白表達

將心肌組織切碎，加入RIPA裂解液后在勻漿機中研磨，充分裂解后，12000rpm離心5min，取上清，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，經灌膠、電泳、電轉、封閉后分別與NF-κB、H-FABP及Gapdh的一抗（抗體滴度分別為1：1000，1：5000）4℃雜交過夜，然后TBST洗膜3次，與辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（Jackson 1∶5000）作用室溫孵育2h，再次洗膜5次，加ECL顯色，上機檢測。以 GAPDH條帶作為內參，結果用靶蛋白/GAPDH 灰度比值表示。

5.4 QPCR檢測TLR4 mRNA表達 將心肌組織切碎，液氮研磨成粉狀，加入RIPA裂解液漩渦震蕩混勻，采用磁珠吸附方法抽提組織RNA。使用RTreagent Kit反轉錄試劑盒（Takara生產，貨號RR047A），將1μg RNA 樣本反轉錄成cDNA進行后續RT-PCR檢測。RT-PCR檢測采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒（深圳輝諾生物科技公司生產，貨號MX200017），嚴格按照操作說明書進行。采用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System 系統，兩步法 PCR擴增標準程序進行PCR反應。相關基因引物序如下：rTLR4：CCGCTCTGGCATCATCTTCATGGGTTTT AGGCGCAGAGTT，rGAPDH：AGGTGACCGCATCTTCTTGTTACGGCCAAATCCGTTCACA。

6 統計學處理

采用 SPSS 21.0統計軟件進行分析。計數資料采用χ2檢驗。計量數據以（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05顯示有統計學意義。

結 果

1 一般性觀察

模型組大鼠前24h死亡3只，24～48h死亡2只，普遍出現進食水減少、蜷縮、毛發蓬松、精神萎靡等癥狀。低、中劑量組前24h各有1只大鼠死亡，高劑量組無死亡大鼠。中藥各組大鼠癥狀較模型組輕。模型組死亡率高于中藥各組總死亡率（χ2=6.23，P=0.012）。假手術組大鼠術后進食及活動量有所下降，后逐漸恢復正常。正常組活動及進食正常。

2 各組TNF-ɑ、IL-6水平比較

模型組及中藥各劑量組心肌TNF-ɑ、IL-6含量術后均較正常組明顯升高（P＜0.01）。隨著時間延長，TNF-ɑ、IL-6含量逐漸降低。中藥各組與模型組同時間點TNF-ɑ、IL-6比較差異也有統計學意義（P＜0.01）；中藥各組之間比較，劑量越高，TNF-ɑ、IL-6降低越明顯（P＜0.01或P＜0.05）。見表 1。

表1 各組TNF-ɑ、IL-6水平比較（）

表1 各組TNF-ɑ、IL-6水平比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與低劑量組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與中劑量組比較，eP＜0.05

指標 時間 只數 正常組/pg·mL-1假手術組/pg·mL-1模型組/pg·mL-1低劑量組/pg·mL-1中劑量組/pg·mL-1高劑量組/pg·mL-1 IL-6術前 5 189.64±5.81 187.35±6.02 191.86±9.41 188.92±12.91 189.82±8.32 187.08±10.86術后 24h 5 187.43±5.85 195.35±7.93 585.22±31.52a 472.62±16.34ab 361.48±12.42abc 291.34±14.68abde術后 48h 5 187.57±5.78 192.61±7.52 455.07±25.42a 377.47±15.73ab 294.35±14.54abc 255.88±14.23abde術后 72h 5 188.78±5.63 194.45±8.31 374.71±12.73a 300.92±25.04ab 266.45±18.95abc 212.76±16.54abde TNF-ɑ術前 5 182.44±9.33 184.14±8.37 183.52±10.85 185.35±10.26 184.37±9.26 183.63±11.42術后 24h 5 183.71±9.42 189.72±9.15 677.83±62.76a 585.92±43.07ab 486.23±25.33abc 422.86±32.04abde術后 48h 5 180.18±9.47 188.37±8.98 527.84±40.34a 477.79±32.45ab 395.49±22.45abc 342.24±32.87abde術后 72h 5 184.22±9.84 186.28±8.27 409.66±52.85a 381.46±20.66ab 284.16±26.97abc 228.66±33.05abde

3 各組NF-κB、H-FABP蛋白表達比較

正常組、假手術組心肌組織NF-κB 和H-FABP蛋白表達水平低。模型組及中藥各劑量組造模成功后檢測到的蛋白水平比正常組均明顯升高（P＜0.05）；中藥各劑量組與模型組同時間點NF-κB、H-FABP蛋白表達比較差異也有統計學意義（P＜0.05）；中藥不同組間對比，劑量越高，心肌組織NF-κB 、H-FABP蛋白表達下調越顯著（P＜0.05）。見表2。

表2 各組心肌組織NF-κB、H-FABP蛋白表達水平比較（）

表2 各組心肌組織NF-κB、H-FABP蛋白表達水平比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05

指標 時間 只數 正常組 假手術組 模型組 低劑量組 中劑量組 高劑量組NF-κB術前 5 1.01±0.02 1.02±0.03 1.01±0.04 1.01±0.02 1.03±0.04 1.04±0.03術后 24h 5 1.03±0.03 1.05±0.06 3.18±0.21a 2.74±0.17ab 2.16±0.12ab 1.76±0.15abc術后 48h 5 1.05±0.02 1.03±0.05 2.59±0.22a 1.92±0.21ab 1.47±0.15ab 1.25±0.11bc術后 72h 5 1.04±0.03 1.10±0.12 2.11±0.17a 1.66±0.14 ab 1.22±0.08b 1.11±0.05bc H-FABP術前 5 1.54±0.12 1.52±0.13 1.53±0.11 1.52±0.10 1.55±0.12 1.57±0.13術后 24h 5 1.55±0.13 1.63±0.16 3.69±0.26a 3.02±0.21ab 2.95±0.20ab 2.46±0.18abc術后 48h 5 1.52±0.11 1.59±0.15 3.35±0.22a 2.74±0.18ab 2.57±0.18ab 2.14±0.17 abc術后 72h 5 1.55±0.14 1.62±0.16 2.71±0.14a 2.12±0.13ab 1.85±0.15b 1.66±0.14bc

4 各組心肌組織TLR-4 mRNA 表達比較

與正常組比較，模型組和中藥各劑量組心肌TLR-4mRNA表達均明顯升高（P＜0.01）；隨著時間的延長，TLR-4mRNA表達下降，與模型組比較，中藥各劑量組TLR-4 mRNA表達下降明顯，劑量越高，降低的越明顯（P＜0.01 或P＜0.05）。見表 3。

表3 各組心肌組織TLR-4 mRNA 表達比較（）

表3 各組心肌組織TLR-4 mRNA 表達比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01，與低劑量組比較，dP＜0.01，與中劑量組比，eP＜0.05.

時間 只數 正常組 假手術組 模型組 低劑量組 中劑量組 高劑量組術前 5 0.96±0.14 1.06±0.19 1.03±0.18 1.02±0.16 1.06±0.15 1.04±0.12術后 24h 5 1.01±0.13 1.07±0.18 34.66±6.19a 26.96±4.74ab 19.81±4.17ac 11.74±3.18acde術后 48h 5 0.98±0.15 0.96±0.16 22.89±4.62a 16.73±3.63ab 9.75±2.21ac 4.37±1.08acde術后 72h 5 1.02±0.15 0.97±0.15 14.62±3.41a 7.56±1.29 ab 4.63±1.59ac 1.79±0.45cde

討 論

膿毒癥的本質是感染誘發的器官功能障礙，其中心肌抑制尤為常見，其誘發的嚴重心衰是導致膿毒癥患者死亡的重要原因[13]。炎癥反應被認為是膿毒癥心肌抑制的主要發病機制之一[14]。TNF-ɑ、IL-6是全身炎癥時候細胞分泌的重要炎癥介質，并且在目前的相關動物實驗研究中，發現TNF-ɑ可以促進心肌炎性改變以及心肌細胞的凋亡從而引起心臟功能障礙[15]。H-FABP是診斷超早期心肌損傷的敏感標志物，其特異性高[16]。研究發現，膿毒癥發生后1h 患者血清H-FABP水平已普遍升高，其升高程度與膿毒癥死亡率呈正相關[17]。TLRs 是一類廣泛存在于血細胞、淋巴組織和心肝腎腦等重要臟器細胞膜上的固有免疫受體，可以介導宿主的免疫應答反應[18]。其中TLR4是識別革蘭陰性菌細胞外壁脂多糖成分的主要受體，并通過相關的信號通路激活NF-κB，活化的NF-κB啟動眾多炎癥因子包括IL-6、TNF-α等的表達上調，而導致炎癥信號進一步擴大，從而加重心臟損傷。

本研究發現，在通過CLP法誘導制造動物模型后，模型組及各中藥治療組的TNF-ɑ、IL-6的水平達均明顯升高，并在24h時到最高水平，其后開始出現下降趨勢，且同時期NF-κB 和H-FABP蛋白表達水平及TLR4基因表達情況也在造模成功后24h達到最高峰，并隨著時間的延長逐漸下降，而正常組及假手術組心肌組織TNF-ɑ、IL-6水平并沒有升高，而且同時NF-κB 和H-FABP蛋白表達及TLR4基因表達情況也未出現明顯變化，證明了出現全身炎癥反應時，心肌細胞會受到抑制并出現損傷，該結果與國內相關研究結果相一致[19-20]。

膿毒癥屬于中醫學外感熱病的范疇，中醫學認為膿毒癥的基本病因病機是正虛毒損、瘀滯絡脈。茯苓四逆湯由茯苓、人參、附子、甘草、干姜組成，具有扶正益氣，溫陽通絡利水之功效。前期我們發現，茯苓四逆湯能抑制慢性心力衰竭患者炎癥反應、改善臨床癥狀、減輕心肌重構、提高患者生存質量[21]。本研究中，中藥各組總體病死率低于模型組，且中藥各組心肌細胞TNF-α、IL-6水平較模型組明顯下降，其中，高劑量組作用更加明顯。說明茯苓四逆湯可以抑制膿毒癥大鼠的炎癥反應，減少炎癥因子的釋放，進而改善預后。同時我們發現，中藥各組心肌組織NF-κB的蛋白表達水平及TLR-4mRNA的表達水平均比模型組低，且隨著中藥濃度的增高差異越顯著，進一步明確了茯苓四逆湯對心肌抑制的保護機制是通過抑制TLR-4介導的炎癥通路實現對膿毒癥心肌抑制的保護。

綜上，茯苓四逆湯能減少膿毒癥大鼠病死率，減輕膿毒癥大鼠心肌損傷，降低心肌細胞炎癥因子含量和心肌組織中NF-κB蛋白和TLR-4mRNA的表達，證實該保護作用是通過抑制 TLR4 介導的炎癥反應實現的。