益腎疏肝方對去卵巢驚恐大鼠海馬Glu/GABA陽性神經元表達的影響*

劉鶴玢，宋玉娟，張鵬飛，李雅婧，韓延華

1 廣東省深圳市龍華區中心醫院 廣東深圳 518000

2 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院 黑龍江哈爾濱 151000

圍絕經期是女性特殊生理階段，會出現一系列與絕經相關的癥狀、體征及情緒心理變化，其中以情緒障礙為最不適之癥。驚恐障礙（Panic Disorder，PD）是一種典型的心身疾病，主要特征為驚恐、呼吸急促、頭暈心悸、震顫汗出等癥狀反復發作，常伴瀕死感、失控感，具有預期焦慮和回避行為[1]。圍絕經期女性因特殊的生理心理特點成為本病高發人群，嚴重影響其身心健康和生活質量[2]。現代醫學認為，神經系統中的谷氨酸（Glutamic acid，Glu）和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric，GABA）是維持大腦興奮/抑制最重要的神經遞質，二者參與介導大腦中90%以上的神經傳導。研究發現，GABA含量減少導致Glu/GABA平衡失調可能是情志障礙發生的病理生理基礎[3]。神經解剖學研究發現，杏仁核、下丘腦、海馬等腦組織共同組成“恐懼環路”，該系統異常可能與驚恐障礙發生發展密切相關[4]。現代醫學治療本病具有諸多缺陷，如不良反應多、復發率高、易藥物依賴等[5-6]。因此，找尋圍絕經期PD有效的中醫藥防治方法具有重意義。益腎疏肝方是韓延華教授治療本病的經驗方，前期臨床研究證實其具有良好療效。本研究旨在以Glu/GABA平衡失調機制入手，以Wistar雌性大鼠作為研究對象，通過建立驚恐情緒影響下去卵巢大鼠模型，觀察大鼠行為學水平、血清E2水平及腦海馬區Glu/GABA陽性神經元表達水平，探究益腎疏肝方在調節實驗大鼠行為學、雌激素及神經遞質方面所發揮的作用。

材料與方法

1 動物與環境

健康育齡未孕雌性Wistar大鼠[7]60只（SPF級），體重180～220g，鼠齡6～8周，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司（許可證號：SCXK（京）2016-0006）。實驗飼料來源于廣東省醫學實驗動物中心，為SPF級普通飼料。大鼠自由攝食攝水，室溫22～26℃，相對濕度50%～60%。

2 材料與儀器

無菌手術刀片、止血鉗、剪刀 、鑷子（上海醫療器械有限公司）；非可吸收外科縫合線4-0（杭州華威醫療有限公司）；顯微鏡（Mshot M152，廣州明美科技有限公司）；顯微攝影系統（Canon EOS600D）；電子天平（賽多利斯科學儀器公司）；精密鼓風干燥箱（BPG-9140A，上海一恒科學儀器公司）；醫用冷藏冷凍箱（YCD-EL259A，中科美菱低溫科技公司）；離心機（KUBOTA2420）；振蕩混勻器（Vortex Mixer）；酶標分析儀（RT-6500，深圳雷杜生命科學公司）；曠場實驗敞箱參照文獻自制[8]；自動組織脫水機（LEICA ASP200S）；包埋機冷熱臺（Histo Core Arcadia C）；生物組織攤烤片機（孝感亞光醫用技術公司）；半自動石蠟切片機（萊卡MR2245）

3 藥物與試劑

伊紅染液、蘇木素染液（珠海貝索生物技術公司）；無水乙醇（廣東光華科技股份有限公司）；標準級顯微鏡載玻片（江蘇世泰實驗器材公司）；中性樹膠（上海懿洋儀器公司）；PBS solution（B548117-0500，生工生物工程公司）；水合氯醛溶液（H07022737，南方醫科大學南方醫院）；阿普唑侖（H32020215，江蘇恩華藥業）；戊酸雌二醇片（H20160679，拜爾醫藥保健廣州分公司）；雌二醇定量分析酶聯免疫檢測試劑盒（201810，安徽巧伊生物科技公司）；中藥顆粒：廣東一方制藥。4%多聚甲醛（大連美侖生物技術公司）；抗體稀釋液（ABD-0030，福州邁新生物技術開發公司）；免疫組化抗原修復液（基因科技上海有限公司）；一抗：Anti-L-Glutamate antibody（ab9440）（批號：GR3221963-1，美 國 abcam 公 司）；一 抗：Anti-GABA antibody（ab171413）（批 號：GR19646-48，美國abcam公司）；二抗：NovoLink聚合物檢測系統（RE7280-K，德國Leica公司）。

4 動物分組

Wistar雌性大鼠60只適應性喂養1周后，隨機選取10只行假手術（A組），其余50只去卵巢大鼠隨機分為5組：去卵巢組（B組）、模型組（C組）、戊酸雌二醇組（D組）、阿普唑侖組（E組）、中藥組（F組），每組10只。

5 模型制備

5.1 去卵巢模型制備 參考文獻制備[9]，所有大鼠禁食水12h后予10%水合氯醛（0.4mL/100g）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，于大鼠下腹部正中、恥骨聯合上方1cm處行一長約2～3cm縱形切口。進入腹腔后于雙側腎臟外下方可見乳白色脂肪組織，輕提即見雙側子宮角，沿其末端摘除被脂肪組織覆蓋的卵巢組織（約綠豆大小、紫紅色、呈桑葚樣）。假手術組大鼠在打開腹腔后僅暴露雙側卵巢。術后第5天起，逐只對每組大鼠行陰道涂片，1次/d，連續5d。根據陰道脫落細胞涂片中角化細胞所占百分率，計算角化指數。角化指數＜50%提示大鼠動情周期發生改變，符合圍絕經期特點，即去勢徹底。

5.2 驚恐模型制備 根據中醫學“恐傷腎”理論，予“貓嚇鼠”制備驚恐模型[10]。術后第10天開始，C、D、E、F四組大鼠每日接受“貓嚇鼠”1h：將鼠籠放于貓籠附近，該貓兇狠善捕鼠，大鼠通過視覺（籠中大鼠可以看到貓）、聽覺（聽到貓的叫聲及抓撓聲）、嗅覺（嗅到貓的排泄物氣味）等多種感官刺激體驗到天敵的存在。鼠籠鐵絲網可有效阻擋貓的攻擊以保證大鼠安全。共連續驚嚇28天。

6 實驗給藥

術后第10天起，逐只對每組大鼠經口灌胃，連續28天。A、B、C三組予生理鹽水3mL/d；D組予戊酸雌二醇溶液3mL/d；E組予阿普唑侖溶液3mL/d；F組予益腎疏肝方混懸溶液3mL/d。給藥期間，每周稱重1次，根據體重變化及時調整劑量。

治療劑量按照人和動物體表面積折算等效劑量比值表換算：大鼠劑量（g/kg）＝成人劑量（g）×0.018/0.2kg。阿普唑侖日成人劑量0.8mg，折算大鼠等效劑量0.072mg/kg。戊酸雌二醇日成人劑量1mg，折算大鼠等效劑量0.09mg/kg。中藥成人日1劑口服（具體藥物組成：五味子、石菖蒲、枳實各12g，山藥、遠志、合歡皮、益智仁各15g，龍齒、珍珠母、茯神、枸杞子、白芍各20g，郁金10g，炙甘草6g），折算大鼠等效劑量2.052g/kg。

7 觀察指標

末次給藥后2h行曠場實驗，以此作為大鼠行為學評定指標。觀察3分鐘內大鼠自主運動情況。分別記錄水平運動得分（水平穿越方格總和，以大鼠所有爪子均進入同一格記1分）、垂直活動得分（兩只前爪離開底面，騰空或攀附四壁，每次記1分）。末次給藥后24h，各組大鼠取靜脈血3mL，室溫靜置2h，離心（2000r/min，10min）分離血清 1mL，裝置于 1.5mL塑料離心管中，放置于-20℃冰箱保存待行血清E2測定。每組隨機選取5只大鼠行心臟灌注，開顱取腦海馬組織，在4%多聚甲醛中固定12h，放置于4℃冰箱保存待行。

8 統計方法

所有數據均采用SPSS 21.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05認為有統計學差異，P＜0.01認為有顯著統計學差異。

結 果

1 各組大鼠曠場實驗得分比較

與A組比較，其余5組大鼠水平、垂直活動得分均明顯低下，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。與C組比較，D組、E組、F組大鼠水平、垂直活動得分均顯著升高，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。F組大鼠水平、垂直活動得分均明顯高于去C組、D組及E組，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠曠場實驗得分比較（）

表1 各組大鼠曠場實驗得分比較（）

與 A 組 比 較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與 B 組 比 較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 C 組比較，□P＜0.05，□□P＜0.01；與 E 組比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與 D 組比較，○P＜0.05，○○P＜0.01

組別 例數 水平活動得分 垂直活動得分A假手術組 10 30.10±1.58 16.60±0.92 B去卵巢組 10 16.40±1.56△△ 8.30±0.90△△□□C模型組 10 12.90±1.14△△ 4.80±0.75△△D戊酸雌二醇組 10 18.10±1.04△△□□ 7.90±0.83△△□□E阿普唑侖組 10 17.70±0.78△△□□ 7.70±1.10△△□□F 中藥組 10 22.20±1.60△△**□□◆◆○○13.40±1.28△△**□□◆◆○○

2 各組大鼠血清E2水平比較

與A組比較，E組E2水平降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；B組、C組E2水平明顯低下，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。F組E2水平明顯高于B組、C組和E組，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01），與 D 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清E2水平比較（）

表2 各組大鼠血清E2水平比較（）

與 A 組 比 較，△P＜0.05，△△P＜0.01；*與 B 組 比 較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 C 組比較，□P＜0.05，□□P＜0.01；與 E 組比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與 D 組比較，○P＜0.05，○○P＜0.01

組別 例數 E2/pmol·L-1 A假手術組 10 373.73±47.49 B 去卵巢組 10 283.12±38.33△△C 模型組 10 256.92±44.65△△D戊酸雌二醇組 10 350.27±22.21**□□E 阿普唑侖組 10 330.08±30.57△*□□F 中藥組 10 362.19±12.35**□□◆◆

3 各組大鼠海馬Glu、GABA陽性神經元表達

海馬CA1區Glu陽性神經元表達：與A組比較，其余5組大鼠顯著增加，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。與B組比較，C組大鼠明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；E組、F組顯著降低，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。F組顯著低于C組、D組，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01），低于E組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

海馬CA1區GABA陽性神經元表達：與A組比較，其余5組顯著降低，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。與B組比較，C組大鼠明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；E組、F組顯著增加，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。F組顯著高于C組、D組，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01），稍高于E組，差異無統計學意義（P＞0.05）。

海馬CA3區Glu陽性神經元表達：與A組比較，其余5組顯著增加，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。與B組比較，C組明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；D組、E組、F組顯著降低，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。F組顯著低于C組、D組，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01），稍低于E組，差異無統計學意義（P＞0.05）。

海馬CA3區GABA陽性神經元表達：與A組比較，其余5組顯著降低，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。與B組比較，C組顯著降低，F組、E組顯著增加，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。F組顯著高于C組、D組，差異具有顯著統計學差異（P＜0.01），高于 E 組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表 3、表 4。

表3 海馬CA1區Glu、GABA陽性神經元表達比較（）

表3 海馬CA1區Glu、GABA陽性神經元表達比較（）

與 A 組 比 較，△P＜0.05，△△P＜0.01；*與 B 組 比 較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 C 組比較，□P＜0.05，□□P＜0.01；與 E 組比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與 D 組比較，○P＜0.05，○○P＜0.01

組別 例數 Glu GABA A假手術組 5 30.20±2.14 29.40±2.06 B去卵巢組 5 51.80±3.19△△ 18.20±2.48△△C 模型組 5 60.40±4.41△△* 14.60±2.21△△*D戊酸雌二醇組 5 49.60±2.06△△□□ 20.40±1.97△△□□E 阿普唑侖組 5 42.60±1.36△△**□□○○ 22.60±1.88△△**□□F 中藥組 5 38.80±2.32△△**□□○○◆ 24.80±1.95△△**□□○○

表4 海馬CA3區Glu、GABA陽性神經元表達比較（）

表4 海馬CA3區Glu、GABA陽性神經元表達比較（）

與 A 組 比 較，△P＜0.05，△△P＜0.01；*與 B 組 比 較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 C 組比較，□P＜0.05，□□P＜0.01；與 E 組比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；與 D 組比較，○P＜0.05，○○P＜0.01

組別 例數 Glu GABA A假手術組 5 26.20±2.14 25.80±1.94 B去卵巢組 5 48.20±2.79△△ 15.60±1.50△△C 模型組 5 54.60±3.26△△* 12.20±1.06△△**D戊酸雌二醇組 5 44.60±1.85△△**□□ 15.40±1.88△△□□E阿普唑侖組 5 38.60±2.33△△**□□ 18.20±1.86△△*□□○F 中藥組 5 34.80±2.40△△**□□○○ 20.80±1.06△△**□□○○◆

討 論

本研究通過“貓嚇鼠”制備大鼠恐懼情緒，將貓作為應激源進行刺激，隨著應激次數增多，大鼠活動性、興奮程度、適應能力受抑制狀態越來越明顯，焦慮、驚恐程度顯著加劇。曠場實驗是用于評估、探究實驗動物行為、情緒狀態的經典方法，在實驗研究中經常被使用[5]。水平活動反映大鼠活動與興奮性，垂直活動反映對陌生環境的適應性。將兩個維度之和作為曠場實驗總分，即從總體上反應大鼠行為學水平。通過對大鼠的曠場實驗行為學評定，也完成了對驚恐造模成功的明確指認和驗證。研究結果表明，在3個治療組中，中藥組效果最好。益腎疏肝方功效補腎疏肝、寧心安神，既可調節去卵巢所致腎虛，糾正“貓嚇鼠”所致“恐傷腎”，又能糾正“腎腦失濟”狀態。

雌激素具有調節女性生殖內分泌、調控情緒認知、調節大腦神經傳導、影響神經遞質功能，通過一系列復雜的生理學、心理學機制，影響中樞神經系統，雌激素受體基因轉錄也有助于調節情緒行為變化[11]。雌激素缺乏與腦功能之間的關系已受到普遍關注[12]。雌激素水平減少，會直接破壞神經元生長，神經遞質活性下降，大腦功能衰退，產生負性情緒[13-14]。與同期健康者比較，情志障礙者雌激素水平降低更為顯著[15]。圍絕經期PD發生與卵巢功能衰退、雌激素水平低下導致大腦功能退化密切相關。本研究結果發現，中藥益腎疏肝方能夠參與調節性激素合成與轉化，提高去卵巢驚恐大鼠內源性雌激素水平，改善恐懼情緒。

Glu/GABA分別為中樞神經系統中最重要的興奮/抑制氨基酸類神經遞質。二者平衡對于穩定中樞神經系統神經元結構、維持大腦神經細胞興奮/抑制平衡狀態發揮重要作用[16]。GABA通過GABA能通路包括GABA受體、GABA的合成代謝或Glu/GABA穩定發揮中樞興奮性神經元抑制作用產生鎮靜作用[17]。當平衡狀態被破壞時會出現焦慮、抑郁、恐懼等情緒障礙等精神類疾病的發生[18]。本研究是以Glu/GABA作為切入點探究益腎疏肝法調節腦功能的作用機制。神經解剖學研究證實，“恐懼環路”結構主要包括杏仁核、下丘腦、海馬等。海馬作為大腦額葉邊緣皮質的特殊區域，既是應激損傷敏感區，也是HPA軸的高位調節中樞，是大腦邊緣系統的重要組成部分，參與學習、記憶，與情緒、行為活動密切相關[19]。海馬組織內傳入神經元和傳出神經元均屬于Glu能神經元，中間神經元均為GABA能神經元。應激損傷發生時，HPA軸被過度激活，糖皮質激素水平顯著升高，Glu釋放含量增加，GABA水平明顯下降[20]。海馬區內Glu長時間高水平狀態會損傷海馬神經元的興奮性。細胞外過量Glu又使HPA軸功能亢進，再度釋放糖皮質激素，進一步削弱海馬對HPA軸負反饋調節作用，而GABA與GABAA受體結合后，HPA軸也會受到明顯抑制。PD患者發病時，GABA和Glu能系統激活HPA軸。海馬中Glu和GABA水平變化是情緒障礙發生、情緒行為異常的重要因素。因此，本實驗通過建立驚恐情緒影響下去卵巢大鼠模型，將“恐懼環路”結構中的重要一環、與情緒行為活動密切相關的海馬作為腦組織的重點區域進行研究，運用免疫組織化學法，檢測各組大鼠海馬GABA及Glu能陽性神經元表達的變化，從Glu/GABA角度探究益腎疏肝法調節腦功能的作用機制。本研究發現，驚恐情緒影響下去卵巢大鼠海馬CA1、CA3區域Glu陽性神經元表達明顯增加，GABA陽性神經元表達明顯減少，致Glu/GABA失衡。益腎疏肝方能夠顯著降低Glu陽性神經元表達，提高GABA陽性神經元表達，有助于改善驚恐情緒影響下去勢大鼠海馬CA1、CA3區域Glu/GABA失衡狀態。

本病屬中醫學“五志”中“恐”的范疇。腎藏精，精生髓，髓上奉于腦。“腦為髓之海”，大腦為精髓、神明匯聚之處，是精神、意識、思維活動之紐帶。女子年值“七七”，腎氣虛，精血衰，天癸竭，腦竅失養，肝失疏泄，心神失養，神明則亂。“恐傷腎”，恐懼作為一種不良情緒刺激，損傷腎氣，致腎氣腎精不足。因此，腎氣漸衰，腎精虧虛，機體功能失調是本病發生的根本原因。益腎疏肝方由五味子、枸杞子、山藥、益智仁、龍齒、遠志、珍珠母、石菖蒲、合歡皮、茯神、郁金、白芍、枳實、炙甘草組成。全方以“固腎”為核心，調補腎之陰陽，促其恢復平衡，益腎疏肝并重，予重鎮安神、養心安神、清心除煩，使心腎交通，心神安寧。配伍入膽經藥物使膽司其職。同時顧護脾胃。全方既強調重點，又各臟腑兼顧，所用藥物平和，體現了中醫學辨證施治之特點。

基于前期研究結果，結合本研究領域最新研究動態，課題組提出下一步研究方向：即從Glu/GABA平衡失調機制入手，以NMDAR1、GABAA受體β2亞基作為研究對象，測定大鼠海馬NMDAR1、GABAAβ2蛋白表達，深入探討益腎疏肝方調節大鼠海馬Glu/GABA系統的作用機制，對于找尋本病發病規律，完善防治方法具有重要意義。