CB1R參與水楊酸鈉誘導大鼠耳鳴研究

葛佳麗 李婷李雅蘭肖倩文左健王采集喬月華*

1徐州醫科大學（江蘇221004）

2徐州醫科大學形態學科研實驗中心（江蘇221004）

3江蘇省人工聽覺工程實驗室（江蘇221004）

4徐州醫科大學附屬醫院（江蘇221002）

耳鳴是指在無外界聲、光刺激的情況下，患者主觀所感知到的一種異常的聲音癥狀。據不完全估計我國耳鳴患者有1.2億，約占總人口的10%，其中進行求醫治療的僅有5%[1]。但迄今為止耳鳴具體發病機制仍然尚未明確，臨床診療效果差，患者仍承受著耳鳴的痛苦。因此，深入研究耳鳴發病機制是解決這一世界性醫學難題的唯一希望。

現有研究顯示大劑量水楊酸可引起人和動物出現聽力下降和耳鳴[2]，同時也是目前國內外耳鳴動物模型的構建方法，該模型具有快速、高效、方便、穩定的優勢[3,4]。目前研究認為水楊酸鈉破壞聽覺通路中興奮和抑制之間的平衡，改變突觸可塑性，導致耳鳴的發生發展[5]。

CB1R首先在大腦中被發現且其在中樞神經系統以及外周神經系統中均存在表達[6]。CB1R通過抑制突觸前終末γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸的釋放以及氮氧化物的產生，具有抗興奮毒性作用、神經保護作用[7]，或許在水楊酸鈉誘導耳鳴過程中存在重要調控機制。

因此，本研究在水楊酸誘導大鼠耳鳴模型中，以聽覺中樞信號傳導起始部位——蝸核為重點研究對象，探索CB1R在不同時間水楊酸誘導耳鳴模型中的表達變化，對其可能機制進行深入討論。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物的選擇

本次實驗使用健康、雄性清潔級SD大鼠60只，體重為250～270克，購買自徐州醫科大學實驗動物中心。實驗期間所有大鼠均飼養于通風屏障系統內，室溫為24℃～26℃，12小時光照交替，自由飲水進食，保持墊料干燥潔凈。本實驗所有流程符合徐州醫科大學動物中心動物倫理管理條例規定。

1.1.2 試劑

實驗用水楊酸鈉購買于美國Sigma公司（置于4℃冰箱長期保存），BCA測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），兔多克隆抗CB1抗體（Abcam公司），鼠單克隆抗β-actin（美國Proteintech公司），CB1R引物以及內參β-actin（上海生工生物工程有限公司），羊抗兔熒光二抗（Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立及分組

所有動物模型的建立均參照先前研究穩定模型[8]。本次實驗隨機選取雄性SD大鼠60只，按隨機分組法分為NS 7天組、SS 7天組、NS 14天組、SS 14天組，每天分別給予SS組7%SS 200mg/kg，對照NS組給予相同劑量0.9%NS腹腔注射。連續給藥，每日兩次，給藥時間分別為上午8時以及下午16時。

1.2.2 PPI檢測

水楊酸鈉誘導大鼠耳鳴樣行為的檢測均參照既往研究[9]。先隨機給予大鼠10次115dB SPL的脈沖刺激，緊接著隨機給予30次聲刺激，包括10次115dB SPL脈沖刺激、10次沒有前聲的驚跳反射刺激和10次前脈沖驚跳反射刺激。驚跳刺激的時間間隔為27-32s。PPI值計算公式為（1-PPI/ASR）×100%。隨后再次根據公式 PPI（%）=1-（ASRPPI）/ASR×100%，計算前脈沖抑制率。

1.2.3 ABR檢測

ABR測試用Neurosoft公司聽覺腦干誘發反應儀于隔音屏蔽室中進行。4%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，大鼠進入麻醉狀態后，將記錄電極置于外耳道口與顱正中線交叉處皮下插入顱骨與硬腦膜之間，參考電極置于兩側乳突皮下，接地電極置于尾巴根部,給聲音耳機放置距左側外耳道口0.5cm。分別給予大鼠不同頻率的聲信號：Click、Tone burst(6k、8k、10k、12k、16k)。從 80dB SPL開始測試，以10dB SPL逐級遞減，采用“升5降10法”反復測量以確定最低聽閾。

1.2.4 Q-PCR

提取蝸核部位總RNA，用所獲取RNA樣本反轉錄合成cDNA后再進行熒光定量擴增檢測，以βactin作為內參基因，對比分析判斷目的基因CB1R表達情況。CB1R引物上游：CCTGCTGAACTCCACCGTGAAC，下游為：CTGTGTTGTTGGCGTGCTTGTG；內參β-actin引物上游：CCCTGGCTCCTAGCACCAT，下游：TAGAGCCAATCCACACAG。均由上海生工生物工程有限公司合成。CB1R基因表達變化采用比較閾值法即計算2-△△CT[10]。

1.2.5 Western Blot

取適量組織置于蛋白酶抑制劑和裂解液中勻漿，離心后收集上清，測定蛋白濃度。電泳分離蛋白后轉膜，5%脫脂奶粉封閉2h，一抗選用兔多克隆抗CB1R（1:200）和鼠單克隆抗GAPDH（1:5000）孵育過夜，TBST洗滌后，熒光標記二抗(1:150)室溫孵育2h，TBST再次洗滌后，應用Odyssey紅外成像系統（美國Li-COR公司）掃描蛋白條帶。選用GAPDH作為內參照，并用Image J軟件對免疫印跡條帶進行半定量分析。

1.2.6 免疫熒光染色

實驗前將制備的16um冰凍切片室溫下放置20-30min復溫；PBS清洗后封閉（5%山羊血清與10%Triton按100：3的比例混合）；一抗為兔多克隆抗CB1R（1:200）孵育過夜，二抗為羊抗兔紅色二抗（1：200）孵育1h。DAPI復染，PBS漂洗后滴加抗熒光淬滅封片膠后蓋上玻片，指甲油封片，正置熒光顯微鏡下觀察拍照，統計腦片單位面積平均熒光強度。

2 數據分析

采用SPSS16.0統計學軟件對數據進行分析，兩組間均數差異性比較使用獨立樣本t檢驗，多組間均數差異性比較使用單因素方差分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 水楊酸鈉誘導大鼠耳鳴行為的產生

與對照NS7天組相比，SS7天組大鼠PPI2、PPI4以及PPI8均有顯著增加（t=-5.325,P=0.006;t=-8.148,P=0.001;t=-3.301,P=0.03,P<0.05）；與NS14天相比，SS14天組大鼠PPI2、PPI4以及PPI8均有顯著增加（t=-13.858,P=0.000;t=-4.872,P=0.008;t=-4.712,P=0.009,P<0.05）,具有統計學意義（圖1）。前脈沖抑制率越大，驚跳反射被抑制的幅度越小。注射水楊酸鹽后大鼠出現耳鳴樣行為，耳鳴填補了背景噪聲的間隔，從而減小了前抑制作用。

圖1 水楊酸鈉注射后對于前脈沖抑制率的影響。A、B分別為給予SS7天與SS14天后大鼠前脈沖抑制率變化；前脈沖刺激：PPI2：75dB SPL；PPI4:80dB SPL；PPI8：85dB SPL(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)（n=15）。Fig.1 Effect of sodium salicylate injection on the inhibition rate of prepulse.A and B show the changes of pre pulse inhibition rate of rats after 7 and 14 days of chronic injection of sodium salicylate;pre pulse stimulation:PPI2:75dB SPL;PPI4:80dB SPL;

PPI8:85dB SPL(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)(n=15).

3.2 水楊酸鈉引起大鼠短暫性聽力下降

應用ABR檢測儀對大鼠聽力閾值檢測后發現（圖2）：相比于對照NS7天組，SS7天組大鼠聽力閾值均有上移（t=-2.0,P=0.116;t=-0.5,P=0.643;t=-1.0,P=0.374;t=-0.378,P=0.725;t=-1.0,P=0.374;t=-1.225,P=0.288,P>0.05），與NS14天組相比，SS14天組大鼠聽閾均有上移（t=-1.414，P=0.23;t=-2.121,P=0.101;t=-2.121,P=0.101;t=-2.0,P=0.116;t=-0.707,P=0.519;t=-1.061,P=0.349，P>0.05），但并無統計學差異。注射水楊酸鈉后，不同時間組不同頻率下耳鳴大鼠均伴有輕微聽力損失出現。

圖2 不同時間慢性注射水楊酸鈉后對于大鼠聽力影響。A、B分別為給予SS慢性注射7天與14天后大鼠聽力閾值變化；數值均用均數±標準差表示（n=15）。Fig.2 Effects of chronic injection of sodium salicylate at different times on hearing of rats.A and B show the change of hearing threshold of rats after 7 and 14 days of chronic injection of sodium salicylate;the values are expressed by mean±standard deviation(n=15).

3.3 CB1R在蝸核中mRNA表達

實時熒光定量PCR結果分析顯示（圖3）：SS注射7天后，CB1R在大鼠蝸核中的表達均有明顯增加（t=2.968,P=0.0412,P<0.05），而在 SS注射 14天后，CB1R在大鼠蝸核中的表達均有明顯降低，差異具有統計學意義（t=4.168,P=0.014,P<0.05）。

圖3 水楊酸鈉誘導耳鳴模型中CB1R在蝸核中mRNA表達變化。A：SS注射7天后耳鳴大鼠蝸核中CB1 mRNA表達增加（P=0.0412,*P<0.05）（n=5）；B：SS注射14天后耳鳴大鼠蝸核中CB1 mRNA表達減少（P=0.014,*P<0.05）（n=5）。Fig.3 Changes of CB1R mRNA expression in cochlear nucleus of tinnitus model induced by sodium salicylate.A:CB1 mRNA expression increased in the cochlear nucleus of tinnitus rats after 7 days of sodium salicylate injection(P=0.0412,*P<0.05)(n=5);B:CB1 mRNA expression decreased in the cochlear nucleus of tinnitus rats after14 days of sodium salicylate injection(P=0.014,*P<0.05)(n=5).

3.4 CB1R在蝸核中蛋白表達

蛋白結果分析顯示（圖4）：SS注射7天后，CB1R在大鼠蝸核中的表達均有明顯增加（t=2.866,P=0.0457,P<0.05），而在SS注射14天后，CB1R在大鼠蝸核中的表達均有明顯降低，差異具有統計學意義（t=3.216,P=0.0324,P<0.05）。

圖4 水楊酸鈉誘導耳鳴模型中CB1R在蝸核中蛋白表達變化。A：SS注射7天后耳鳴大鼠蝸核中CB1R蛋白表達增加（P=0.0457,*P<0.05）（n=5）；B：SS注射14天后耳鳴大鼠蝸核中CB1R蛋白表達減少（P=0.0324,*P<0.05）（n=5）。Fig.4 Protein expression of CB1R in cochlear nucleus of tinnitus model induced by sodium salicylate.A:after 7 days of sodium salicylate injection,CB1R protein expression in the cochlear nucleus of tinnitus rats increased(P=0.0457,*P<0.05)(n=5);B:after 14 days of sodium salicylate injection,CB1R protein expression in the cochlear nucleus of tinnitus rats decreased(P=0.0324,*P<0.05)(n=5).

3.5 CB1R在蝸核中熒光表達

免疫熒光結果分析顯示（圖5）：SS注射7天后，CB1R在大鼠蝸核中的表達均有明顯增加（t=2.207,P=0.0423,P<0.05），而在SS注射14天后，CB1R在大鼠蝸核中的表達均有明顯降低，差異具有統計學意義（t=8.234,P=0.0000,P<0.05）。

圖5 水楊酸鈉誘導耳鳴模型中CB1R在蝸核中平均熒光強度表達變化。A，C：SS注射7天后耳鳴大鼠蝸核中CB1R平均熒光強度增加（P=0.0423,*P<0.05）（n=5）；B，D：SS注射14天后耳鳴大鼠蝸核中CB1R平均熒光強度減少（P=0.0000 ,****P<0.0001）（n=5），標尺20μm。Fig.5 Changes of CB1R expression in cochlear nucleus of tinnitus model induced by sodium salicylate.A,C:after 7 days of sodium salicylate injection,the average fluorescence intensity of CB1R in the cochlear nucleus of tinnitus rats increased(P=0.0423，*P<0.05)(n=5);B,D:after 14 days of sodium salicylate injection,the average fluorescence intensity of CB1R in the cochlear nucleus of tinnitus rats decreased(P=0.0000,****P<0.0001)(n=5)，Scale bar:20μm.

4 討論

早在1991年早期放射自顯影研究中，CB1R在耳蝸核（CN）中就已被發現[11]；2007年Zheng等人第一次系統性地研究了在大鼠耳蝸核中CB1R空間分布，通過免疫組化法定位CB1R在耳蝸背側核和腹側核不同細胞類型中均有表達，且在水楊酸誘導耳鳴大鼠中發現腹側蝸核中CB1R表達明顯減少[12]；2016年Toal K L等人研究顯示CB1R敲除小鼠對于高頻8kHz～24kHz的聲音辨別能力有明顯缺失[13]；2016年Hwang等人研究發現在小鼠耳鳴模型中，CB1R在蝸核、腦干和下丘、海馬和海馬旁、顳葉以及額葉中均有表達且表達明顯降低[14]。以上證據均證實CB1R不僅在聽覺系統中必不可少，而且在水楊酸誘導耳鳴的過程中也發揮著重要的作用。

CB1R在突觸發育以及可塑性調節中具有重要作用。研究表顯示在聽力開始前(P5)和聽力開始時(P12)的大鼠中，CB1R調節發育中的MNTB（斜方體中核）-LSO（外側上橄欖核）突觸的強度[15]；除此之外，當GABA能神經元上CB1R敲除時，小鼠海馬CAl區錐體神經元的頂樹突和底樹突的分枝長度及頂樹突的樹突棘密度均有明顯減少，長時程增強（LTP）作用減弱，突觸可塑性被損害；而在谷氨酸神經元上CB1R敲除后，錐體神經元頂樹突的分枝長度及樹突棘密度均明顯增加，LTP作用因此增強[16]。王洪田等人在透射電鏡觀察下發現水楊酸誘導耳鳴大鼠聽皮層突觸形態學發生異常，突觸的數量、形態、界面曲率、突觸間隙、面積、活性區以及突觸后致密物質厚度均有明顯增加變化[17]。這些結果顯示CB1R是參與中樞神經系統突觸發育調節的重要受體之一，而水楊酸誘導耳鳴可能是CB1R參與調節突觸重塑改變的過程。

本次實驗結果分析發現，水楊酸鈉連續注射7天以及14天誘導耳鳴樣行為的產生。且在蝸核中CB1R在7天耳鳴模型中表達增加，14天耳鳴模型中CB1R表達降低。CB1R在14天耳鳴模型中表達降低這與Zheng等人研究結果一致，但在隨后更多的研究中顯示CB1R激動劑的使用并未緩解耳鳴，反而加重了大鼠耳鳴程度，不適合用于臨床藥物治療[18-22]。這樣結果的原因可能是相比于抑制興奮性神經遞質的釋放，可能CB1R對于抑制性神經遞質釋放的抑制作用更強。因此本文研究認為CB1R在7天和14天耳鳴模型表達變化可能原因有兩點：一點可能是由于鈣離子內流、NMDAR過度興奮繼而CB1R激活，表達增加，發揮其抗興奮毒性作用，但CB1R對GABA釋放抑制作用更強，興奮抑制平衡未能恢復，而長期過強興奮毒性刺激導致CB1R出現負反饋調節；另一點可能是由于水楊酸誘導耳鳴產生以及維持的過程中CB1R通過介導興奮性以及抑制性遞質的釋放誘導突觸后LTP以及LTD產生，導致突觸損害并出現重塑性變化。因此盡管既往研究顯示CB1R具有抗興奮毒性以及神經保護作用，但本次蝸核研究結果中卻并未發現，CB1R在不同時間模型中變化反而顯示其可能會促進耳鳴的發生發展。

總之，內源性大麻素受體在長期應用水楊酸鈉從而導致耳鳴的發生發展的過程中發揮著重要的作用，但在這過程中CB1R可能調節突觸重塑的機制還需要進一步實驗探究。