基于ITS2條形碼鑒別南大青葉的PCR-RFLP研究

黃韻璇，朱曉燕，侯惠嬋，陳偉盛

廣州市藥品檢驗所 國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，廣東 廣州 510000

歷史上使用的“大青葉”來源有4個基原，分別為十字花科植物菘藍Isatis indigoticaFort.的干燥葉、蓼科植物蓼藍Polygonum tinctoriumAit.的干燥葉、爵床科植物馬藍Baphicacanthus cusia(Nees) Bremek.的干燥葉、馬鞭草科大青Clerodendrum cyrtophyllumTurcz.的干燥葉。其中，菘藍的干燥葉和蓼藍干燥葉分別以“大青葉”和“蓼大青葉”收載在《中國藥典》2020年版；馬藍干燥葉以“大青葉”收載在《四川省中藥材標準》1987年版和《廣東省中藥炮制規范》1984年版；大青干燥葉以“大青葉（馬大青葉）”收載在《湖南省藥材標準》2009年版。在《中國藥典》2020年版一部中，菘藍的干燥根和干燥葉分別被收載為“板藍根”和“大青葉”[1]，而馬藍的干燥根莖和根被收載為“南板藍根”[1]，本實驗所述“南大青葉”為爵床科植物馬藍的干燥葉。

馬藍為草本植物，主要分布于我國華南、西南和華東地區，由于馬藍產量限制與各地區的使用習慣不同，市售的南大青葉易為同科混偽品（如球花馬藍葉、廣西馬藍葉、疏花馬藍葉、少花馬藍葉等）或不同科屬的大青葉和菘藍葉等[2]。傳統的顯微鑒別和化學鑒別易受基原植物的生長環境影響[3]，而且對操作人員的技術背景有一定要求，鑒別結果準確度不高。因此，采用基于DNA條形碼（DNA barcoding）技術的分子鑒別方法作為傳統鑒別手段的補充，可以有效降低南大青葉的鑒別難度，加強基原物種馬藍相關藥材、飲片和中成藥的質量監管，提高民眾用藥安全[4]。

DNA條形碼技術是通過一段短的、標準的DNA序列進行物種鑒定的分子技術，鑒定結果不受物種個體形態特征和發育階段的影響，操作流程簡單規范，不過度依賴操作人員的經驗，經過近些年的發展已廣泛應用于海關、法醫、動植物檢驗檢疫、食品、藥品及化妝品檢測等多個領域[5]。在中藥材鑒定方面，陳士林團隊創建了基于ITS2、psbA-trnH、COI的DNA條形碼生物鑒定體系[6]，并且該方法已納入《中國藥典》2020年版，收載的中藥材中，川貝母的鑒別項下包含了基于ITS1條形碼測序分析的聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）法[1]。該方法是針對限制性酶切位點限制性片段長度變異的一種常用的生物基因型鑒定方法，它在PCR的基礎上利用限制性內切酶和瓊脂糖凝膠電泳檢測能準確區別川貝母與其混偽品。

參照《中國藥典》2020年版四部中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則，選用ITS2序列為主體序列，以葉綠體psbA-trnH為輔助序列，對36批南大青葉樣品進行序列比對，探索馬藍與其近緣種在分子水平上的差異。并且，通過分析馬藍及其近緣物種的DNA條形碼位點差異，建立南大青葉基于ITS2基因和限制性內切酶Sma I的PCR-RFLP鑒別方法。

1 材料與儀器

1.1 材料

本實驗用36批南大青葉藥材信息見表1。其中，陽性對照藥材P2～P4和P6～P15為自采樣本，經廣州市藥品檢驗所中藥室侯惠嬋主任中藥師鑒定為馬藍B.cusia(Nees) Bremek.；陰性對照藥材N14、N16～N21樣品分別為爵床科垂序馬藍Strobilanthes japonicus(Thunb.) Miq.、爵床科艷蘆莉Ruellia elegansPoir.、爵床科翠蘆莉R.simplexC.Wright.、爵床科狗肝菜Dicliptera chinensis(L.) Juss.、爵床科云南山殼骨Pseuderanthemum crenulatu(Wallich ex Lindley) Radlkofer.疑似品、馬鞭草科大青C.cyrtophyliumTurcz.和十字花科菘藍I.indigoticaFortune.。

表1 36批南大青葉樣品編號和來源信息Table 1 Serial number and source of 36 batches of materials

1.2 儀器和試劑

SIGMA 1-14K型高速離心機（美國SIGMA公司）；水浴搖床WNB14（德國Memmert公司）；PCR擴增儀9700（美國AB Applied Biosystems公司）；分析天平PM200（瑞士Mettler Toledo公司）；凝膠成像系統GelDoc XR＋（美國Bio-Rad公司）；組織粉碎儀pulverisette23（德國IKA公司）。

植物基因組DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini Ki（QIAGEN）；PrimeSTAR Max Premix（Takara Bio）；DL 2000 DNA Marker（Takara Bio）；Gelred染料（Biotium）；Sma I Fastdigest（ThermoSciense）；ITS2序列正向引物ITS2F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向引物ITS3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’（華大基因）；psbA-trnH序列正向引物psbAF：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’，反向引物trnHR：5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’（華大基因）。

2 方法

2.1 DNA的提取

取樣品約20 mg，置組織粉碎儀中制成細粉，按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣品DNA。

2.2 PCR擴增

擴增ITS2和psbA-trnH分別使用ITS2R/ITS3F和fwd/rev引物對，反應總體積為20 μL，DNA模板加入量為0.5～1.0 ng，反應參數為98 ℃預變性30秒，循環反應30次（98 ℃、10 s，56 ℃、15 s、72 ℃、20 s），72 ℃延伸5 min。

2.3 測序與比對分析

將PCR產物委托華大基因進行正反向測序，測序引物為PCR反應引物。獲得的雙向測序峰圖文件利用SeqMan軟件進行序列拼接，再去除測序結果兩端信號弱或重疊峰區域，使序列方向與PCR擴增正向引物方向一致。拼接的序列使用基于隱馬爾科夫模型的 ITS2注釋網站（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de）進行標注[7]，再在MEGA 10.0.5軟件上采用Clustal W方法比對分析樣品序列，繪制Neighbor-joining（N-J進化樹）。

2.4 Sma I酶切反應

酶切反應總體積為20 μL，反應體系包括10×酶切緩沖液2 μL，PCR反應液10 μL，Sma I 0.5 μL，無菌水7.5 μL，反應在37 ℃水浴進行。

3 結果與分析

3.1 南大青葉及其混偽品的DNA條形碼鑒定

參照《中國藥典》2020年版四部通則9107中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則，選用ITS2為主體序列，葉綠體psbA-trnH為輔助序列對36批樣品進行分子鑒定。所有樣品的DNA條形碼片段均成功擴增，psbA-trnH測序得到約510 bp的序列信息，而含有重復GC片段的ITS2序列難以測通，經過拼接和去除信號弱的區域僅得到大小約為300 bp、包含28S motif區域的片段序列。

將所有樣品ITS2基因的可測序部分的序列用Clustal W方法分析比對繪制N-J進化樹（圖1），再將樣品序列輸入NCBI數據庫進行BLAST比對（表2），結果顯示P1～P15樣品與馬藍的相應序列完全一致；N1～N10樣品與馬藍的ITS2序列存在位點差異，相似度為96%；N13～N15樣品與馬藍ITS2序列的差異位點較多，相似度為93%，而且在進化樹上表現為屬于P1～P15和N1～N12的外群；N16～N21樣品與其他物種ITS2序列較一致，與馬藍的序列差異較大。另外，將P1～P15、N1、N3、N9、N15樣品的psbA-trnH序列進行比對，P1～P15與N9無位點差異，N1、N3、N15與其他序列僅有2個位點的差異，說明psbA-trnH不適用于馬藍鑒定。因此，上述36批樣品按中藥材DNA條形碼分子鑒定，P1～P15的物種鑒定為馬藍，為南大青葉正品，N1～N15的物種鑒定為馬藍同科近緣物種，為南大青葉混偽品，N16～N21為其他科屬物種，為南大青葉混偽品。

表2 36批樣品ITS2部分序列的BLAST比對結果Table 2 BLAST result based on part of ITS2 sequeces of 36 samples

圖1 基于36批樣品部分ITS2序列的N-J進化樹Fig.1 N-J tree based on part of ITS2 sequences of 36 samples

3.2 南大青葉PCR-RFLP法鑒別方法建立

根據所有樣品ITS2的測序結果，南大青葉正品比對混偽品有2個穩定的關鍵差異位點（圖2），其中一個位點在限制性內切酶Sma I的識別區域CCCGGG中，即南大青葉ITS2基因擴增產物約500 bp，經Sma I酶切可形成2條大小分別約為200 bp和300 bp的DNA片段，以此可建立相應的南大青葉PCR-RFLP鑒別方法。另外，按中藥材DNA條形碼鑒定指導原則采用56 ℃退火溫度擴增南大青葉樣品的ITS2基因，擴增產物在300 bp位置有非特異性條帶影響酶切后目的條帶的觀察，因此使用58 ℃的退火溫度進行PCR-RFLP反應更適用于南大青葉的鑒別。

圖2 限制性內切酶Sma I在馬藍ITS2基因序列中的識別位點示意圖Fig.2 Recognition site of restriction enzyme Sma I in ITS2 sequences of B.cusia and its adulterants

3.3 南大青葉PCR-RFLP法鑒別方法驗證

按《中國藥典》2020年版四部9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則分別考察上述PCRRFLP鑒別方法的專屬性和耐用性。

3.3.1 專屬性試驗 按“2.1”“2.2”項對36批樣品進行DNA提取，利用PCR反應擴增樣品ITS2基因，退火溫度為58 ℃，然后用Sma I Fastdigest酶切PCR產物，反應15 min，酶切產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示，南大青葉正品P1～P15在200～300 bp位置有2個明亮的酶切的條帶，均呈陽性反應；南大青葉混偽品N1～N21和空白對照在200～300 bp處無條帶，均呈陰性反應（圖3）。結果說明上述PCR-RFLP方法用于鑒別南大青葉符合《中國藥典》2020年版四部9101專屬性的要求。

圖3 36批南大青葉樣品PCR-RFLP鑒別結果Fig.3 Identification result of 36 batches of samples with PCR-RFLP method

3.3.2 耐用性試驗 取3批南大青葉正品和3批南大青葉混偽品按上述PCR-RFLP反應進行鑒別，分別使用與專屬性試驗不同的植物DNA提取試劑盒（北京天根、北京中科瑞泰）、ITS2通用引物（Invitrogen）、退火溫度（60 ℃）、DNA聚合酶（Promega GoTaq?DNA聚合酶、Promega Taq DNA聚合酶）、Sma I限制性內切酶（Promega、ThermoSciense）和1 h酶切反應時間，各反應體系與條件參考商品化試劑說明書。結果顯示，所有樣品的在500 bp的位置均有PCR產物條帶；南大青葉正品的酶切產物在200～300 bp位置有2個酶切條帶，呈陽性反應；南大青葉混偽品無酶切條帶，呈陰性反應（圖4）。因此，上述PCR-RFLP方法用于鑒別南大青葉符合《中國藥典》2020年版四部9101耐用性的要求。

圖4 PCR-RFLP法鑒別南大青葉的耐用性考察Fig.4 Robustness of PCR-RFLP identification method with B.cusia

4 討論

本實驗針對南大青葉鑒別建立的PCR-RFLP方法是基于DNA分子條形碼ITS2的分析應用。經過對36批中藥材南大青葉及混偽品的序列分析，南大青葉所屬物種馬藍的ITS2序列與疏花馬藍、關節馬藍、垂序馬藍等近緣物種的有明顯的位點差異，與艷蘆莉、翠蘆莉、狗肝菜、云南山殼骨、大青和菘藍等混偽品的有較大種間差異。而且，黃志海等[8]分析馬藍、菘藍、蓼藍和大青的ITS2條形碼序列，結果發現4個物種在N-J進化樹上也能明顯區分。因此，ITS2作為鑒定馬藍的DNA分子條形碼具備良好的適用性。凃媛[9]針對馬藍、蓼藍和菘藍等含靛玉紅類中藥材的4種DNA條形碼序列進行了擴增分析，結果發現ITS2序列的擴增效率及測序成功率較低，進而采用T-A克隆法獲得高質量測序結果。蔣超等[10]采用堿裂法提取各類藥材DNA發現來自植物葉樣品的DNA純度比根和莖的較高，但PCR擴增效率最低。本研究采用硅膠膜吸附柱和離心柱法提取干燥葉樣品中的基因組DNA，經紫外分光光度計測定所得DNA溶液純度較低，在260 nm吸光度值較大，直接用作模板會影響擴增效率或導致擴增失敗。但是，用適量無菌純化水將模板DNA稀釋后再加入PCR反應體系中，所有樣品的ITS2序列均能成功擴增，表明采用簡單的稀釋模板步驟可提高中藥材DNA序列的擴增效率，減少植物中多糖、多酚和部分次級代謝產物對擴增反應的抑制作用。

在《中國藥典》2020年版一部的收載品種中，南板藍根為馬藍的干燥根莖或根，青黛為馬藍、蓼藍或菘藍的葉或莖葉經加工制成的干燥粉末、塊團或顆粒，二者采用的鑒別方法為顯微鑒別、化學鑒別和針對靛藍與靛玉紅的薄層色譜法[1]。本研究建立的PCR-RFLP法對馬藍物種的鑒別具有良好的專屬性和耐用性，因此同樣適用于鑒別南板藍根，方法快捷高效，結果準確，有效彌補了傳統的鑒別手段主觀性強、準確性低、樣品用量大等不足。同時，魏藝聰等[11]通過對20條樣本信息的SNP分析發現matK序列可以用于鑒別馬藍和大青，但本研究表明馬藍與其近緣物種的psbA-trnH基因不存在明顯的變異位點，因此基于DNA條形碼分子技術建立相應的鑒定體系，在鑒別中藥材青黛方面也有著重要的應用前景。

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