基于譜效關聯分析篩選竹葉椒揮發油抗菌質量標志物

李毛加，沙玉茹，羅曉敏，龔普陽，顧 健

西南民族大學藥學院，四川 成都 610041

竹葉椒又稱萬花針、崖椒、蜀椒或藤椒等[1]，是蕓香科花椒屬植物竹葉椒Zanthoxylum armatumDC.的果實，氣香、味微甜而辛[2]。竹葉椒最早記載于《本草圖經》，其種質資源豐富，廣泛分布于我國四川、云南、貴州、西藏等地。由于竹葉椒具有溫中燥濕、散寒止痛、驅蟲止癢等功效[3]，被廣泛用于醫藥、食品、衛生、化妝品等多個領域。竹葉椒的藥用部位為根、莖、葉、果實，根莖含有多種生物堿、木脂素等成分，果實主要富含揮發油。揮發油是竹葉椒藥效物質組分之一，主要包含萜類、酮類、醛類、酯類、醇類等多種化合物[4]。研究發現，花椒屬植物揮發油具有作為鎮痛劑、抗氧化劑及抑菌藥物的潛質[5]。課題組前期對竹葉椒不同部位進行抗菌活性篩選，發現竹葉椒揮發油部位抗菌效果最佳[6]。因此，本研究通過建立不同產地竹葉椒揮發油指紋圖譜，結合抗菌活性評價，采用聚類分析法[7]、主成分分析法[8]以及灰色關聯分析法[9]，進一步研究其抗菌質量標志物（quality marker，Q-Marker）[10]，為其質量控制提供參考依據。

1 材料

1.1 藥材

采購不同產地竹葉椒（S1～S10），經西南民族大學藥學院顧健教授鑒定均為蕓香科花椒屬植物竹葉椒Z.armatumDC.的果實。

1.2 菌株

大腸桿菌（編號45977）、金黃色葡萄球菌（編號45986）、紅色毛癬菌（編號340195）、須鮮毛癬菌（編號340405）購自北京北納生物科技有限公司。

1.3 藥品與試劑

醋酸乙酯（批號20191112）、無水硫酸鈉（批號20200612）、鹽酸（批號20200311）、比濁管（批號20190522）購自天津化學試劑有限公司；石油醚（批號20191212）購自科龍化學有限公司；二甲基亞砜（DMSO，批號20200812）、生理鹽水（批號20200111）、無水硫酸鈉（批號20200313）、無水乙醇（批號20201112）購自天津福晨化學試劑有限公司；沙氏葡萄糖液體培養基（批號20190783）、肉湯培養基（批號20188771）購自北京北納生物科技有限公司。

1.4 儀器

7980B 5977C氣相色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫公司）；JA2003型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；SB-4200D型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MH-2000型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；ZWY-200D型智誠恒溫培養振蕩器、CHP-8型恒溫培養箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 竹葉椒揮發油的制備

稱取竹葉椒80 g，加入1.6 L水和數粒玻璃珠混合均勻，于電熱套上緩慢加熱至沸騰，保持微沸1 h，用無水硫酸鈉吸收揮發油中殘留水，即得竹葉椒揮發油。

2.2 不同產地竹葉椒揮發油指紋圖譜的建立

2.2.1 供試品的制備 稱取適量10批不同產地的竹葉椒揮發油，用甲醇配制成質量濃度為38.46 mg/mL的供試品溶液。

2.2.2 色譜條件 DB-5色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度為230 ℃；氣化室溫度為280 ℃；分流比為100∶1；進樣量為1 μL；載氣為氦氣；色譜柱初始溫度為40 ℃，以15 ℃/min升溫至70 ℃，繼續以0.5 ℃/min升至73 ℃；以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；以20 ℃/min升至300 ℃，保持20 min。

2.2.3 質譜條件 電子轟擊離子源；離子源溫度為230 ℃；四級桿溫度為150 ℃；掃描范圍為m/z20～600；電離電壓為70 eV。

2.3.4 竹葉椒揮發油指紋圖譜的建立 按“2.2.1”項下方法制備供試品，進樣測定。通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2004A版），以S1批次樣品圖譜為參照圖譜，采用中位數法，得到10批竹葉椒揮發油指紋圖譜。

2.3.5 不同產地竹葉椒揮發油相似度分析及共有峰的指認 將10批竹葉椒揮發油指紋圖譜保存為AIA格式，用2004A版指紋圖譜相似度軟件，對10批竹葉椒揮發油色譜指紋峰進行匹配。以S1批次樣品的指紋圖譜為保留時間參考標準，經過多點校正、自動匹配，自動匹配共生成16個共有峰，計算相似度。

2.3.6 聚類分析和主成分分析 將10批竹葉椒揮發油峰面積進行標準化處理，采用SPSS 26.0軟件進行聚類分析和主成分分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 樣品穩定性試驗 取S10批次供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，計算各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD，RSD均為2.0%～2.6%，表明樣品穩定性較好。

2.4.2 儀器精密度試驗 取S10批次供試品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件連續進樣6次，色譜峰峰面積RSD均小于2.8%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 方法重復性試驗 按“2.2.1”項下方法制備6份S10批次供試品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，色譜峰峰面積RSD均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.5 竹葉椒揮發油抗菌實驗

2.5.1 供試品的制備 適量稱取10批不同產地竹葉椒揮發油，用DMSO溶液配制成質量濃度為100 mg/mL的供試品溶液。

2.5.2 菌懸液的制備 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌分別于37 ℃生化培養箱中培養1 d，加入4 mL肉湯培養基。將菌懸液轉入10 mL離心管中，于搖床搖晃4 h得到菌懸液，靜置10 min。

將紅色毛癬菌、須鮮毛癬菌分別劃線接種于SDA平板，于28 ℃生化培養箱中培養7 d，向斜面加入3 mL無菌生理鹽水，用接種環刮取。將菌懸液轉入10 mL離心管中，于渦旋儀渦旋1 min，得到菌懸液，靜置10 min。用沙氏葡萄糖液體培養基稀釋成1×106cfu/mL的接種菌液。

2.5.3 含藥濾紙片的制備 用打孔器把定性濾紙制成6 mm的圓形紙片，高壓滅菌后，將其浸泡于竹葉椒揮發油供試品中。

2.5.4 含菌平板的制備 用涂布棒分別將200 μL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、紅色毛癬菌和須鮮毛癬菌的菌懸液均勻涂布于固體平板上，晾干。將平板分成3個區域并標記，用鑷子將含藥濾紙鋪于平板標記區域，將平板倒置，于37 ℃生化培養箱中培養，每天觀察抑菌效果，測量抑菌圈。

2.6 結合灰色關聯分析法分析竹葉椒揮發油譜效關系

灰色關聯分析法是建立中藥譜效關系的常用方法之一。灰色關聯分析法是通過計算指紋圖譜共有特征峰與藥效之間關聯度的大小，以確定各共有特征峰對藥效的貢獻值[11-12]。本研究以金黃色葡糖球菌抑菌圈、大腸桿菌抑菌圈、紅色毛癬菌抑菌圈、須鮮毛癬菌抑菌圈直徑為參考序列，10批竹葉椒揮發油指紋圖譜共有峰的峰面積為比較序列，采用灰色關聯分析法，先將原始數據進行均值化處理，再求得絕對差序列、關聯系數和關聯度，最終確定關聯度。

3 結果

3.1 不同產地竹葉椒揮發油含量

如表1所示，云南邵通、水富、黃華、華平4個地區竹葉椒揮發油含量為50.0～102.5 mL/kg；四川達州、漢源、南部、金陽4個地區竹葉椒揮發油含量為60.0～100.0 mL/kg；貴州遵義竹葉椒揮發油含量為115.0 mL/kg；重慶江津竹葉椒揮發油含量為68.8 mL/kg，表明不同產地的竹葉椒揮發油含量存在差異。

表1 不同產地竹葉椒揮發油含量Table 1 Contents of volatile oil of Z.armatum from different areas

3.2 不同產地竹葉椒揮發油GC-MS指紋圖譜

不同產地竹葉椒揮發油指紋圖譜如圖1所示，通過氣-質數據庫NIST08.LIB數據匹配對16個共有峰進行定性鑒別，結果如表2所示。其中，經面積歸一化法測定各成分的質量分數，結果顯示芳樟醇、檸檬烯及檜烯3種化合物質量分數較高。

表2 竹葉椒揮發油指紋圖譜化學成分鑒定結果Table 2 Identification results of chemical constituents of volatile oil of Z.armatum

圖1 10批竹葉椒揮發油GC-MS指紋圖譜 (A) 和對照圖譜 (B)Fig.1 GC-MS fingerprint of volatile oil of Z.armatumin in 10 batches (A) and reference substance fingerprint (B)

3.3 不同產地竹葉椒揮發油相似度分析

如表3所示，S1～S10批次間竹葉椒揮發油的相似度均大于0.97，表明10批竹葉椒揮發油具有高度的一致性和穩定性。

表3 不同產地竹葉椒揮發油相似度Table 3 Similarity of volatile oil of Z.armatum from different areas

3.4 不同產地竹葉椒揮發油指紋圖譜聚類分析

根據10批竹葉椒揮發油指紋圖譜特征峰的峰面積進行聚類分析，如圖2所示，所有樣品被分成2類，第1類包括S7、S8、S9、S10批次；第2類包括S1、S2、S3、S4、S5、S6批次。四川漢源、四川南部、四川金陽、貴州遵義竹葉椒揮發油聚為1類；云南華平、云南邵通、云南水富、云南黃華、四川達州、重慶江津竹葉椒揮發油聚為1類，表明云南各地區竹葉椒品種相似，四川達州與四川漢源、南部和金陽地區竹葉椒品種具有差異；四川達州和重慶江津與云南各地區竹葉椒聚為一類；貴州遵義與四川各地區產地聚為一類，表明不同產地竹葉椒品種具有相似性。

圖2 不同產地竹葉椒揮發油聚類分析Fig.2 Cluster analysis of volatile oil of Z.armatum from different areas

3.5 不同產地竹葉椒揮發油指紋圖譜主成分分析

如圖3所示，不同產地竹葉椒揮發油主成分分析綜合得分排序為芳樟醇＞檸檬烯＞檜烯，表明芳樟醇可以作為竹葉椒揮發油質量評價的重要依據。

圖3 竹葉椒揮發油主成分綜合得分Fig.3 Comprehensive score of main components of volatile oil of Z.armatum

3.6 不同產地竹葉椒揮發油抑菌活性評價

如表4所示，不同產地竹葉椒揮發油對金黃色葡萄球菌的抑菌作用排序為S1＞S2＞S8＞S4＞S3＞S9＞S7＞S5＞S6＞S10；不同產地竹葉椒揮發油對大腸桿菌的抑菌作用排序為S9＞S4＞S7＞S8＞S1＞S6＞S10＞S3＞S2＞S5；不同產地竹葉椒揮發油對紅色毛癬菌的抑菌作用排序為S5＞S8＞S4＞S7＞S2＞S6＞S10＞S9＞S1＞S3；不同產地竹葉椒揮發油對須鮮毛癬菌的抑菌作用排序為S5＞S4＞S2＞S10＞S6＞S8＞S7＞S9＞S1＞S3。表明不同產地竹葉椒揮發油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、紅色毛癬菌、須鮮毛癬菌均有較好的抑制作用，其中云南華平產地竹葉椒揮發油對金黃色葡萄球菌抑菌效果最佳；四川金陽產地的竹葉椒揮發油對大腸桿菌抑菌效果最佳，四川達州產地的竹葉椒揮發油對紅色毛癬菌和須鮮毛癬菌的抑菌效果最佳。

表4 不同產地竹葉椒揮發油抑菌圈直徑 ( ±s , n=3)Table 4 Diameter of bacteriostatic zone of volatile oil of Z.armatum from different areas ( ±s , n=3)

表4 不同產地竹葉椒揮發油抑菌圈直徑 ( ±s , n=3)Table 4 Diameter of bacteriostatic zone of volatile oil of Z.armatum from different areas ( ±s , n=3)

批次 抑菌圈直徑/mm金黃色葡萄球菌 大腸桿菌 紅色毛癬菌 須鮮毛癬菌S1 26.56±0.18 21.09±2.19 14.97±0.71 10.16±0.09 S2 24.00±1.13 18.83±1.91 21.39±0.95 13.59±0.63 S3 19.65±1.73 19.35±0.68 13.08±0.49 9.23±0.48 S4 20.79±2.53 24.80±0.69 22.40±1.00 14.40±0.82 S5 18.66±2.17 14.35±0.84 23.29±0.79 15.88±0.66 S6 17.24±1.79 19.67±1.51 19.71±0.41 13.08±0.79 S7 18.84±0.67 23.65±0.21 21.74±0.94 12.67±0.42 S8 22.57±2.07 23.31±0.46 23.24±0.64 12.97±0.76 S9 19.13±0.15 26.05±1.23 15.03±0.72 10.47±0.58 S10 15.00±1.09 19.52±0.46 18.16±0.79 13.58±0.82

3.7 結合灰色關聯法分析竹葉椒揮發油譜效關系

如表5所示，竹葉椒揮發油共有峰與金黃色葡萄球菌抗菌作用的貢獻關聯度均大于1.41。其中色譜峰6（檸檬烯）與抑制金黃色葡萄球菌相關性最強，關聯度為1.931；各色譜峰與大腸桿菌關聯度均大于0.78，其中色譜峰11（芳樟醇）與抑制大腸桿菌關聯度較高。竹葉椒揮發油共有峰與抗紅色毛癬菌作用的關聯度均大于0.74，其中色譜峰11（芳樟醇）是抑制紅色毛癬菌關聯度最強的色譜峰，其次為色譜峰12（側柏酮）；各色譜峰與抗須鮮毛癬菌作用關聯度均大于0.73，其中色譜峰11（芳樟醇）與色譜峰12（側柏酮）較高。綜合灰色關聯結果表明，檸檬烯、芳樟醇、側柏酮是竹葉椒揮發油中主要的抗菌潛在活性成分。

表5 竹葉椒揮發油色譜峰與抑菌作用的關聯度Table 5 Correlation degree between chromatographic peak and antibacterial effect of volatile oil of Z.armatum

4 討論

竹葉椒作為花椒的亞屬，是食品或保健食品開發的重要原料[13]，但其質量標準體系構建尚未完善。為構建完善的的竹葉椒質量標準體系，將其揮發油主要成分與功效相對應，本研究通過建立不同產地竹葉椒揮發油指紋圖譜，通過GC-MS定性分析，鑒定出16個共有峰的化學成分，并采用聚類分析以及主成分分析法，分析出同一地區不同產地的竹葉椒品種存在差異性。通過計算主成分綜合得分，發現芳樟醇與檸檬烯是其最主要的化學成分，提示芳樟醇和檸檬烯可在不同產地竹葉椒質量區分中發揮重要的作用，可作為其Q-Marker的潛在候選化合物。

竹葉椒主要成分為檸檬烯、芳樟醇等揮發性物質，檸檬烯對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有抑制作用[14-16]，芳樟醇對紅色毛癬菌、須鮮毛癬菌具有抑制作用[17]，表明竹葉椒揮發油中的多種成分可能通過協同作用發揮抗菌作用。本研究根據竹葉椒臨床適應證特點，選擇了金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、紅色毛癬菌和須鮮毛癬菌進一步確證竹葉椒揮發油的抑菌作用。為進一步篩選竹葉椒揮發油的抗菌活性成分，借助灰色關聯分析法發現檸檬烯對金黃色葡萄球菌可能存在較強的抑制作用，芳樟醇與側柏酮對大腸桿菌、紅色毛癬菌及須鮮毛癬菌具有較好的抑制活性。

綜上所述，本研究發現竹葉椒揮發油的抗菌作用來源于多種成分，芳樟醇、檸檬烯、側柏酮可能為竹葉椒的抗菌Q-Marker，為其質量評價以及控制提供了一定的數據支持與理論基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突