藁本內酯對神經干細胞/祖細胞的增殖作用及機制研究

王 敏 ，Hideki Hayashi，劉建勛，Norio Takagi*，任鈞國

1.中國中醫科學院 西苑醫院基礎醫學研究所，北京 100091

2.東京藥科大學 應用生化研究室，東京 192-0392

藁本內酯為川芎和當歸中的內酯類化合物[1]，具有抗炎、抗氧化應激[2]、改善學習記憶[3]、保護血腦屏障[4]、保護神經元[5]、抗腫瘤[6]等藥理作用。中醫理論記載，川芎能夠“上行頭目”，且川芎為臨床治療腦缺血處方中常見配伍藥味之一，藁本內酯為川芎揮發油中含量較大的成分[7-8]。研究顯示，大鼠po藁本內酯后，其在腦中的分布較其他組織中多，表明藁本內酯具有較好的腦靶向性[9]，在治療腦相關疾病中具有潛在的優勢。

腦缺血后，由于溶栓不及時，癱瘓、偏癱、失語以及學習記憶障礙等神經損傷癥狀為腦缺血常見的后遺癥，嚴重影響患者的生活質量和壽命，目前尚無公認的針對缺血后神經修復治療的制劑上市。神經干/祖細胞（neural stem/progenitor cells，NS/PCs）的增殖對于腦缺血后神經元的修復、神經網絡的重構以及后期神經功能的恢復至關重要[10]。本課題組前期研究發現川芎提取物對腦缺血后大鼠體內的神經祖（母）細胞具有增殖作用[11]，本研究擬在此基礎上考察川芎中的主要活性成分藁本內酯對體外NS/PCs的增殖作用。

1 材料

1.1 動物

孕14 d Wistar大鼠購自日本SLC公司，飼養于（23±1）℃、濕度（55±5）%的環境中，自由進食飲水。動物實驗經東京藥科大學動物倫理委員會批準（批準號P20-02）。

1.2 藥品與試劑

藁本內酯對照品（質量分數為86%，批號111737-201608）購自中國食品藥品檢定研究院；β-actin抗體（批號A5441）、Vimentin抗體購自美國Sigma公司；Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS，批號14175-095）、DMEM/F12培養基（批號11320-033）、B27因子（批號17504-044）購自美國Gibco公司；Accutase細胞消化液（批號A11105-01）、Alexa Fluor 488標記親和純化山羊抗兔IgG抗體（批號A11037）、Alexa Fluor 594標記親和純化山羊抗鼠IgG抗體（批號A11029）購自美國Invitrogen公司；DNase I（批號LK003170）購自美國Worthington Biochemical公司；100×雙抗（批號168-23191）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF，批號059-07873）、D-PBS（批號045-29795）購自日本Wako公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，批號166717）、Percoll細胞分離液（批號17-0891-02）購自美國GE Healthcare公司；神經細胞培養添加劑N2 MAX Media Supplement（批號AR009）購自美國RD System公司；成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF，批號031908）購自美國Peprotech公司；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗體（批號4060S）、Akt抗體（批號2920S）、磷酸化糖原合成酶激酶（phosphorylated glycose synthase kinase 3β，p-GSK3β）抗體（批號5558S）、GSK3β抗體（批號9315S）、active-β-catenin抗體（批號8814S）、β3-tubulin抗體（批號5741S）、β-actin抗體購自美國CST公司；WST-1檢測試劑（批號346-06454）、Hoechst細胞核染料（批號346-07951）購自日本DojinDo公司；HRP標記的二抗購自美國Pierce Biotechnology公司。

1.3 儀器

培養瓶（美國Thermo Fisher Scientific公司）；解剖顯微鏡（日本Olympus公司）；6200型離心機（日本Kobota公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；細胞過濾器（美國Falcon公司）。

2 方法

2.1 原代大鼠NS/PCs的分離培養

取孕14 d大鼠，脫頸椎處死，腹部以75%乙醇消毒，快速打開腹腔，取出子宮，以預冷的HBSS溶液清洗2次，轉移至含HBSS溶液的無菌培養皿中，再轉移至無菌分離操作臺，于解剖顯微鏡下打開子宮，取出胎鼠，剪下胎鼠頭，剝離腦膜，分離雙側皮層，無菌手術刀切碎組織（整個操作過程盡量控制在15～20 min完成，以保證較好的細胞活性）。加入6 mL PBS溶液懸浮組織，轉移至離心管中，靜置5 min，棄去上清液；加入2.5 mL含500 μL胰酶、400 μL DNase I的PBS溶液，混勻，于37 ℃水浴中溫育25 min；棄上清，加入5 mL含20% FBS的DMEM/F12培養基，反復吹打，經細胞過濾器（40 μm）濾過，收集濾液；離心，棄上清，加入35% Percoll分離液，將沉淀物轉移至離心管中，混合均勻，離心；加入65% Percoll分離液，離心；轉移上清液至新的離心管中，加入DMEM/F12培養基，混勻，離心；棄上清，再加入DMEM/F12培養基，吹打至肉眼不可見漂浮物，離心；棄上清液，加入N2 plus DMEM/F12培養基，吹打均勻后，進行細胞計數。

細胞接種于培養瓶中，分別加入EGF、FGF（20 ng/mL），輕輕混勻，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養。培養3～4 d，更換培養液；培養6～7 d，收集細胞懸浮液，離心，棄上清液，加入Accutase細胞分離液消化，加入DMEM/F12培養基，吹打至肉眼不可見漂浮物，離心；棄上清液，加入N2 plus DMEM/F12培養基，細胞計數后，按照所需細胞密度接種于培養瓶或培養板中。

2.2 藁本內酯對NS/PCs存活率的影響

NS/PCs以5×104/孔接種于24孔板中，適應30 min。設置對照組和藁本內酯（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μmol/L）組，各給藥組加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養基，培養24 h，按WST-1試劑說明書檢測各組細胞存活率。

2.3 藁本內酯對NS/PCs p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β和active-β-catenin蛋白表達的影響

NS/PCs以1×106/孔接種于6孔板中，設置溶劑組和藁本內酯（25 μmol/L）組，給藥組加入藥物，溶劑組加入0.006%二甲基亞砜（DMSO），培養24 h。收集細胞，以PBS溶液洗滌，棄去上清液，加入110 μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液（含50 mmol/L Tris-HCL、1 mmol/L EDTA、0.1%脫氧膽酸鈉、1% TritonX-100），于冰水浴中超聲裂解。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，加入上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min使蛋白變性，放置至室溫后，于 -80 ℃保存。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h，分別加入p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β、active-β-catenin、β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；以TBST溶液洗滌，加入HRP標記的二抗（1∶5000），室溫孵育1 h；以TBST溶液洗滌，加入ECL發光試劑反應1 min，于成像系統儀中曝光，使用CS Analyzer 4.Version 2.1.2軟件進行定量分析。

2.4 藁本內酯對NS/PCs神經球直徑的影響

NS/PCs以5×105/孔接種于25 cm2培養瓶中，培養4 d。設置溶劑組和藁本內酯（25 μmol/L）組，給藥組加入藥物，溶劑組加入0.006% DMSO。分別于給藥后第1、2、3天，于顯微鏡下拍照，隨機選取5張照片，使用顯微鏡自帶的軟件測量視野下神經球的直徑（直徑＜40 μm不計入）。

2.5 藁本內酯對NS/PCs分化類型的影響

NS/PCs原代分離培養7 d，消化后加入分化培養基（含2% B27、0.5% FBS、1%雙抗的DMEM/F12培養基），調整細胞密度為1×105/mL，以2×104/孔接種于24孔板中（培養板預先用poly-D-lysine溶液包被），設置對照組、溶劑組和藁本內酯（25 μmol/L）組，給藥組加入100 μL藥物，溶劑組加入等體積0.006% DMSO，對照組加入不含藥物的培養基，分化3 d時更換新鮮培養基，分化5 d進行細胞免疫熒光染色。

以PBS溶液洗滌，棄去洗液，加入4%多聚甲醛，室溫固定10 min；棄去固定液，以PBS溶液洗滌，加入0.2% TritonX-100，室溫透化10 min；棄去上清液，加入封閉液，室溫封閉30 min；棄去封閉液，分別加入β3-tublin抗體（1∶500）、vimentin抗體（1∶2000），4 ℃孵育過夜；以PBS溶液洗滌，加入山羊抗兔或鼠IgG抗體（1∶200）孵育1 h；棄去溶液，加入含細胞核染料Hoechst33342（1∶2000）的PBS溶液清洗3次，棄去洗液，封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 藁本內酯對分化細胞存活率的影響

NS/PCs以5×104/孔接種于24孔板中，設置溶劑組和藁本內酯（25 μmol/L）組，按“2.5”項下方法處理細胞，分化3 d時更換新鮮培養基，分化5 d按WST-1試劑說明書檢測各組細胞存活率。

2.7 數據分析

數據以±s表示，使用SAS 8.2軟件進行單因素方差分析，Tukey’s檢驗作事后分析。

3 結果

3.1 藁本內酯對NS/PCs存活率的影響

如圖1所示，與對照組比較，25 μmol/L藁本內酯可顯著增加NS/PCs存活率（P＜0.05）。

圖1 藁本內酯對NS/PCs存活率的影響 (±s, n = 5)Fig.1 Effect of ligustilide on survival rate of NS/PCs(±s, n = 5)

3.2 藁本內酯對NS/PCs p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β和active-β-catenin蛋白表達的影響

如圖2所示，與溶劑組比較，藁本內酯可顯著上調NS/PCs中p-Akt/Akt、active-β-catenin蛋白表達水平（P＜0.05），但對p-GSK3β/GSK3β蛋白表達無明顯影響。

圖2 藁本內酯對NS/PCs p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β和active-β-catenin蛋白表達的影響 (±s, n = 6)Fig.2 Effect of ligustilide on p-Akt, Akt, p-GSK3β, GSK3β and active-β-catenin protein expressions in NS/PCs (±s, n = 6)

3.3 藁本內酯對NS/PCs神經球直徑的影響

如圖3所示，隨著培養時間的增加，NS/PCs神經球直徑逐漸增大；連續給予藁本內酯1～3 d，與溶劑組比較，NS/PCs神經球直徑有所增加，但無統計學差異。

圖3 藁本內酯對NS/PCs神經球直徑的影響 (±s, n = 6)Fig.3 Effect of ligustilide on diameter of neurospheres in NS/PCs (±s, n = 6)

3.4 藁本內酯對NS/PCs分化類型的影響

以β3-tubulin標記神經元，vimentin標記星型膠質細胞，Hoechst33342標記細胞核。如圖4所示，藁本內酯對神經元和星形膠質細胞的分化均無顯著影響。

圖4 藁本內酯對NS/PCs分化類型的影響 (±s, n = 4)Fig.4 Effect of ligustilide on differentiated type of NS/PCs (±s, n = 4)

3.5 藁本內酯對分化細胞存活率的影響

如圖5所示，與溶劑組比較，藁本內酯顯著提高分化細胞的存活率（P＜0.05）。

圖5 藁本內酯對分化細胞存活率的影響 (±s, n = 8)Fig.5 Effect of ligustilide on survival rate of differentiated cells (±s, n = 8)

4 討論

腦缺血后神經元大量死亡，刺激內源性的神經干細胞開始分化，但由于缺血后內環境的惡化，導致新生的NS/PCs逐漸死亡，影響后期的分化和神經單元的重構。因此，維持腦缺血后早期階段NS/PCs的持續增殖和存活是后期神經元和神經功能恢復的基礎[12]。本研究采用課題組前期建立的NS/PCs分離培養方法[13]，獲得生長狀態良好、較穩定的神經球，可用于藥物的研究。由于NS/PCs自我更新和多功能的特性，孕鼠狀態、分離時間、溫度、培養基、操作等細節均會影響細胞懸浮狀態或生長，因此，嚴格控制實驗條件，對于獲得狀態較穩定的細胞至關重要。

細胞的增殖和分化是神經干細胞的2個重要特性。本研究首先檢測了藁本內酯對NS/PCs增殖的影響，WST-1法為檢測細胞數量與活力的方法之一，結果顯示，25 μmol/L藁本內酯可促進NS/PCs增殖，且呈非線性關系。查閱文獻，部分學者報道，藁本內酯在體內的藥動學研究呈非線性[14]，藁本內酯對缺氧缺糖神經細胞PC12具有雙向調節作用[15]，提示對藁本內酯進行研究時，應關注劑量對藥理作用的影響。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-Akt為神經干細胞增殖、存活、分化、遷移中的重要通路[16-17]，Akt、p-GSK3β、activeβ-catenin為PI3K介導的通路中的關鍵蛋白[18]，Akt可直接激活β-catenin或通過GSK3β間接激活β-catenin[19]。正常狀態下，細胞質中的β-catenin與GSK3β、APC等形成蛋白復合體，磷酸化后最終通過泛素化-蛋白酶系統降解；而非磷酸化的β-catenin則轉移至細胞核，與轉錄因子結合，參與細胞的增殖、分化等[20-21]。本研究結果顯示，藁本內酯可通過激活PI3K-Akt/β-catenin通路促進NS/PCs增殖。

神經元和星型膠質細胞是NS/PCs主要的2種分化類型，vimentin為星形膠質細胞早期標志物，β3-tubulin為神經元早期標志物[22]。結果顯示，藁本內酯對星形膠質細胞和神經元細胞分化均無顯著影響，但分化細胞活力卻有所提高；鏡下觀察，未被vimentin或β3-tubulin標記的細胞有所增加，推測藁本內酯可能促進其他類型細胞的分化（圖6）。

圖6 藁本內酯對NS/PCs可能的作用機制Fig.6 Proposed mechanisms of ligustilide on NS/PCs

以往對藁本內酯治療腦缺血損傷的研究主要集中于改善血流或神經保護，對促進神經元修復研究較少。本課題組前期研究發現，川芎提取物對腦缺血后大鼠海馬區神經母細胞增殖具有促進作用。因藁本內酯為川芎中含量較大的成分之一，并且體外篩選其表現出較好的神經藥理活性，故選擇藁本內酯這一研究對象，從促進神經干細胞增殖這一新的角度，闡釋了藁本內酯通過激活Akt/β-catenin通路促進NS/PCs增殖，提示藁本內酯為神經修復治療研究的潛在藥物之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突