秦皮素通過下調(diào)p70S6K抑制人黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲研究

蘭 楠，呂志陽，周雨晴，韓延南，王明心，彭忠祿*，樊竑冶*

1.中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009

2.湘南學院藥學院，湖南 郴州 423099

黑色素瘤是一種侵襲性強、致死率高的惡性皮膚癌。轉移是造成黑色素瘤致死率高的主要原因之一[1]。黑色素瘤對傳統(tǒng)治療手段易產(chǎn)生耐藥性且預后差，其發(fā)病率和死亡率逐年升高[2]。雖然近年來靶向治療和免疫療法取得了一些進展，但其療效有限[3-4]，因此亟待開發(fā)新的藥物和方法治療黑色素瘤。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是細胞生長和代謝的主要調(diào)節(jié)因子，可感知和整合多種營養(yǎng)和環(huán)境因素來平衡營養(yǎng)供應并調(diào)控細胞生長。mTORC1蛋白復合物由mTOR和其他組分組成，具有促進合成代謝的作用，而核糖體蛋白S6的磷酸化常被用來指示mTORC1的活性[5]。mTOR信號轉導異常見于多種癌癥，并與癌癥的耐藥性、轉移、侵襲及預后等密切相關，S6的過度磷酸化與惡性黑色素瘤顯著相關[6]。此外，mTORC1通過激活核糖體S6蛋白激酶（ribosome S6 protein kinase，P70S6K）誘導黑色素瘤發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[7]。盡管雷帕霉素已用于治療胰腺癌，但雷帕霉素、依維莫司和替西羅莫司（mTORC1抑制劑）等在臨床試驗中缺乏對黑色素瘤的客觀反映[8]。

秦皮素是從中藥秦皮中提取出的一種天然香豆素類化合物，具有抗菌、抗氧化、神經(jīng)保護和腫瘤抑制等多種藥理學活性，具有良好的藥物研究和臨床應用價值[9]。秦皮素對乳腺癌、非小細胞肺癌、結腸腺癌等腫瘤細胞的增殖、遷移具有明顯的抑制或促凋亡作用[10-12]，但其對黑色素瘤細胞的作用鮮有報道。本研究探討了秦皮素對人黑色素瘤A375細胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機制，為秦皮素治療黑色素瘤的臨床應用提供理論支持與參考。

1 材料

1.1 細胞

A375細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥品與試劑

秦皮素（質(zhì)量分數(shù)＞98%，批號B20990）購自上海源葉生物公司；p70S6K特異性抑制劑PF-4708671（質(zhì)量分數(shù)＞99%，批號HY-15773）購自美國MedChemExpresss公司；DMEM培養(yǎng)基（批號8121025）、胎牛血清（批號2232246）購自美國Gibco公司；Matrigel基質(zhì)膠（批號9168007）、Transwell小室（批號07920027）購自美國Corning公司；p-mTOR抗體（批號11221）購自美國Signalway Antibody公司；p70S6K抗體（批號2708）、p-p70S6K抗體（批號9234）、S6抗體（批號2217）、p-S6抗體（批號2211）購自美國CST公司；基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP2）抗體（批號AB92536）購自英國Abcam公司；MMP9抗體（批號00673298）、vimentin抗體（批號6619511）購自美國Affinity Biosciences公司；N-cadherin抗體（批號00059228）、HPR標記的羊抗兔IgG抗體（批號SA00001-4）購自美國Proteintech Group公司；β-actin抗體（批號AB0035）購自上海Abways Technology公司。

1.3 儀器

311型氣套CO2培養(yǎng)箱、MSC Advantage 1.5生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ECLIPSE Ts2倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Mini-Protein Tetra垂直電泳槽、濕式轉印槽（美國Bio-Rad公司）；5200 Multi化學發(fā)光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

A375細胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、95%相對濕度、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細胞計數(shù)法檢測細胞增殖

取處于對數(shù)生長期的A375細胞，以2.5×105/mL接種至96孔板中，200 μL/孔，培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后加入藥物，使秦皮素終濃度為25、50、100、200 μmol/L，對照組加入含有等體積藥物溶媒的培養(yǎng)基。每個濃度設置3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，胰酶消化后用血球計數(shù)板對每孔細胞密度進行計數(shù)，計算每孔細胞數(shù)量。

2.3 細胞克隆形成實驗

取處于對數(shù)生長期的A375細胞，以500/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后加入藥物，使秦皮素終濃度為40、60、80 μmol/L，對照組加入含有等體積藥物溶媒的培養(yǎng)基。每3天更換培養(yǎng)基和藥物，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆斑時（約14 d）停止培養(yǎng)；棄去培養(yǎng)液，用PBS溶液洗滌2次后加入1.5 mL 4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1%結晶紫染液染色20 min后流水清洗，待其自然風干后，拍照記錄。

2.4 Western blotting實驗

收集對照組及不同濃度秦皮素或PF-4708671（10 μmol/L）處理48 h后的A375細胞，加入含PMSF的RIPA裂解液提取蛋白，經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液煮沸變性10 min。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入封閉液封閉1 h，分別加入對應的抗體于4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，10 min/次，再加入HPR標記的羊抗兔IgG抗體（1∶10 000）于室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，滴加ECL化學發(fā)光液，采用凝膠成像儀顯影。

2.5 細胞劃痕實驗

A375細胞接種于6孔板，待細胞長滿時，用滅菌的200 μL槍頭垂直于皿底劃線，每孔劃3道劃痕，PBS清洗3次，加入含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加入藥物使秦皮素終濃度為40、60、80 μmol/L，PF-4708671終濃度為10 μmol/L，對照組加入含有等體積藥物溶媒的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于顯微鏡下拍照，使用Image J軟件分析0 h和48 h所拍照片的劃痕面積，計算劃痕愈合率。

劃痕愈合率＝(0 h劃痕面積－48 h劃痕面積)/0 h劃痕面積

2.6 細胞侵襲實驗

用預冷的DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠至230 μg/mL，吸取100 μL Matrigel基質(zhì)膠鋪入Transwell上室，于培養(yǎng)箱放置4 h。取處于對數(shù)生長期的A375細胞，調(diào)整密度為1×106/mL，加入藥物使秦皮素終濃度為80 μmol/L、PF-4708671終濃度為10 μmol/L，對照組加入含有等體積藥物溶媒的培養(yǎng)基。吸取100 μL上述無血清細胞懸液于Transwell上室，下室加入600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 h。Transwell小室經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min后，用0.1%結晶紫染液染色20 min，用濕潤的棉簽擦除Transwell膜上層的細胞，自然風干后，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用GraghPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗分析。

3 結果

3.1 秦皮素對A375細胞增殖和克隆形成的影響

如圖1-A所示，不同濃度秦皮素（25、50、100、200 μmol/L）處理A375細胞48 h后，與對照組比較，秦皮素顯著抑制A375細胞的增殖（P＜0.05、0.01），且呈劑量相關性。經(jīng)計算，秦皮素作用于A375細胞48 h的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為98.03 μmol/L，因此選用40、60、80 μmol/L的秦皮素進行后續(xù)實驗。細胞克隆形成實驗結果見圖1-B，與對照組比較，秦皮素顯著抑制A375細胞克隆形成率（P＜0.01），且呈劑量相關性。表明秦皮素能夠抑制A375細胞的增殖和克隆形成能力。

圖1 秦皮素對A375細胞增殖 (A) 和克隆形成 (B) 的影響 (±s, n = 3)Fig.1 Effect of fraxetin on proliferation (A) and clonality (B) of A375 cells (±s, n = 3)

3.2 秦皮素對A375細胞p70S6K/S6信號通路相關蛋白表達的影響

mTORC1/p70S6K/S6信號通路影響細胞的存活、增殖，且該通路在黑色素瘤中異?；罨?。如圖2所示，秦皮素（40、60、80 μmol/L）處理A375細胞48 h后，對mTOR蛋白的磷酸化水平無影響，但顯著下調(diào)p70S6K及S6蛋白的磷酸化水平（P＜0.01），提示秦皮素可能通過抑制p70S6K/S6信號通路來抑制A375細胞的增殖和克隆形成能力。

圖2 秦皮素對A375細胞p70S6K/S6信號通路相關蛋白表達的影響 (±s, n = 3)Fig.2 Effect of fraxetin on p70S6K/S6 signaling pathway related proteins expressions in A375 cells (±s, n = 3)

3.3 PF-4708671對秦皮素抑制A375細胞增殖和p70S6K/S6信號通路相關蛋白表達的影響

為探究秦皮素是否通過p70S6K/S6信號通路影響A375細胞增殖，給予秦皮素（80 μmol/L）或p70S6K特異性抑制劑PF-4708671（10 μmol/L）處理細胞48 h，細胞計數(shù)結果見圖3-A，PF-4708671和秦皮素均可顯著抑制A375細胞增殖（P＜0.01）。如圖3-B所示，PF-4708671顯著上調(diào)p70S6K蛋白磷酸化水平（P＜0.01），同時下調(diào)S6蛋白磷酸化水平（P＜0.01），與文獻報道一致[13]。提示秦皮素可能通過下調(diào)p70S6K/S6抑制A375細胞增殖。

圖3 PF-4708671對秦皮素抑制A375細胞增殖 (A) 和p70S6K/S6信號通路相關蛋白表達 (B) 的影響 (±s, n = 3)Fig.3 Effect of PF-4708671 on inhibition of fraxetin on proliferation (A) and p70S6K/S6 signaling pathway related proteins expressions (B) in A375 cells (±s, n = 3)

3.4 秦皮素對A375細胞EMT相關蛋白表達的影響

mTORC1/p70S6K/S6信號通路與EMT相關，如圖4所示，秦皮素（40、60、80 μmol/L）處理A375細胞48 h后，顯著下調(diào)間質(zhì)細胞標志物（N-cadherin、vimentin）以及MMP2、MMP9蛋白表達水平（P＜0.05、0.01），提示秦皮素可能通過影響EMT相關蛋白表達抑制A375細胞的遷移和侵襲能力。

圖4 秦皮素對A375細胞EMT相關蛋白表達的影響 (±s, n = 3)Fig.4 Effect of fraxetin on EMT-related proteins expressions in A375 cells (±s, n = 3)

3.5 PF-4708671對秦皮素抑制A375細胞EMT相關蛋白表達的影響

如圖5所示，與對照組比較，秦皮素（80 μmol/L）和PF-4708671（10 μmol/L）處理A375細胞48 h后，均顯著下調(diào)N-cadherin、vimentin、MMP2、MMP9蛋白表達水平（P＜0.05、0.01），提示秦皮素可能通過p70S6K/S6信號通路影響A375細胞EMT相關蛋白表達。

圖5 PF-4708671對秦皮素抑制A375細胞EMT相關蛋白表達的影響 (±s, n = 3)Fig.5 Effect of PF-4708671 on inhibition of fraxetin on EMT-related proteins expressions in A375 cells (±s, n = 3)

3.6 秦皮素和PF-4708671對A375細胞遷移的影響

為探究秦皮素對A375細胞遷移能力的影響，同時避免秦皮素的細胞增殖抑制作用對實驗結果的干擾，細胞劃痕實驗時培養(yǎng)基的血清濃度為1%。如圖6所示，經(jīng)秦皮素（40、60、80 μmol/L）和PF-4708671（10 μmol/L）處理后，A375細胞劃痕愈合率顯著降低（P＜0.01），提示秦皮素可能通過p70S6K/S6信號通路抑制A375細胞遷移。

圖6 秦皮素和PF-4708671對A375細胞遷移的影響 (±s, n = 3)Fig.6 Effect of fraxetin and PF-4708671 on migration of A375 cells (±s, n = 3)

3.7 秦皮素和PF-4708671對A375細胞侵襲的影響

如圖7所示，與對照組相比，經(jīng)秦皮素（80 μmol/L）和PF-4708671（10 μmol/L）處理后，A375細胞轉至Transwell下室的數(shù)量顯著降低（P＜0.01），且二者聯(lián)用時轉移至下室的細胞進一步減少（P＜0.01），提示秦皮素可能通過p70S6K/S6信號通路抑制A375細胞的侵襲能力。

圖7 秦皮素和PF-4708671對A375細胞侵襲的影響 (±s, n = 3)Fig.7 Effect of fraxetin and PF-4708671 on invasion of A375 cells (±s, n = 3)

4 討論

黑色素瘤細胞具有增殖速度快、侵襲和轉移潛能強、早期易轉移等特點。本研究發(fā)現(xiàn)，秦皮素通過抑制p70S6K和S6的磷酸化水平，有效地抑制了人黑色素瘤A375細胞的增殖、遷移和侵襲，提示秦皮素有治療黑色素瘤的潛質(zhì)。

轉移是導致黑色素瘤患者死亡的主要原因。黑色素瘤細胞在轉移之前通常會經(jīng)歷EMT，表現(xiàn)為上皮細胞特性逐漸消失，并出現(xiàn)間質(zhì)細胞特征，而發(fā)生EMT的腫瘤細胞更容易發(fā)生遷移和侵襲[14]。N-cadherin和vimentin是間質(zhì)細胞標志蛋白，其蛋白表達水平的升高是細胞發(fā)生EMT的重要特征。N-cadherin是一種黏附分子，主要介導細胞與細胞間的動態(tài)黏附。N-cadherin表達上調(diào)可增強多種上皮癌細胞在體外的遷移和侵襲能力[15-17]。Vimentin是中間纖維蛋白最主要的組成成分，與微管、微絲共同構成細胞骨架，參與調(diào)控細胞黏附、細胞形狀變化和遷移速度。研究表明，在EMT過程中，vimentin表達增加導致細胞黏附性減弱、細胞形態(tài)改變、細胞運動性增強[18]。MMP2和MMP9可促進基底膜以及胞外基質(zhì)中明膠和膠原蛋白降解，增強細胞侵襲能力；在發(fā)生EMT的黑色素瘤細胞中，MMPs表達上調(diào)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，秦皮素抑制了A375細胞中N-cadherin、vimentin、MMP2和MMP9蛋白表達，提示秦皮素可能通過抑制A375細胞的EMT來抑制細胞的遷移和侵襲，從而阻止黑色素瘤細胞轉移。

p70S6K是屬于AGC激酶家族的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以被不同的生長因子或胰島素樣因子通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/mTOR通路磷酸化[20]。S6是核糖體40S亞基的重要蛋白質(zhì)組成成分，是p70S6K激酶下游的重要靶蛋白。p70S6K/S6信號通路對腫瘤細胞的增殖、存活、細胞周期進展等有重要作用。抑制p70S6K可抑制乳腺癌細胞遷移[21]；敲除p70S6K會抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖及裸鼠中腫瘤形成[22]；敲除S6可以抑制上皮性卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，秦皮素以p-mTOR非依賴性的方式下調(diào)了p70S6K和S6的磷酸化水平。為研究秦皮素對A375細胞的作用是否依賴于p70S6K激酶活性，使用p70S6K的特異性抑制劑PF-4708671進行對照實驗，發(fā)現(xiàn)PF-4708671上調(diào)了p70S6K蛋白的磷酸化水平，下調(diào)了S6蛋白的磷酸化水平，與文獻報道一致[13]；PF-4708671抑制了A375細胞的增殖、遷移、侵襲，與秦皮素效果類似，表明秦皮素可能通過p70S6K/S6信號通路抑制A375細胞的增殖、遷移和侵襲。

p-mTOR上調(diào)表明mTORC1活性增加，mTORC1可以直接磷酸化下游蛋白p70S6K。本研究結果顯示，秦皮素上調(diào)p-mTOR蛋白表達，下調(diào)p-p70S6K和p-S6蛋白表達。由于蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）是mTOR的上游激酶，而p-S6能夠負反饋抑制Akt活性[24]，因此當秦皮素下調(diào)p-S6表達后，其對Akt的負反饋抑制作用解除，導致mTOR被活化即p-mTOR上調(diào)。推測秦皮素可能通過與mTOCR1或其調(diào)控因子結合而抑制mTOCR1活性，從而影響其對p70S6K的磷酸化；秦皮素在抑制mTORC1活性的同時累積了mTOR在S2448位點的磷酸化。秦皮素對mTORC1/p70S6K/S6信號通路的具體調(diào)控機制仍需進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突