基于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)-熵權(quán)逼近理想解排序法（TOPSIS）優(yōu)選巴戟天酒炙工藝及炮制前后藥效對(duì)比研究

劉夢云，秦祎苒，劉秋怡，丁 平

廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalisHow的干燥根，是我國“四大南藥”之一，主要分布于廣東、廣西、海南等地區(qū)。具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用，是我國傳統(tǒng)補(bǔ)腎陽中藥之一，臨床用于陽痿遺精、宮冷不孕、風(fēng)濕痹痛、筋骨痿軟等癥[1]。現(xiàn)代科學(xué)研究表明巴戟天主要含蒽醌、環(huán)烯醚萜、寡糖及多糖等化合物，具有抗抑郁、抗炎、抗骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)免疫力、改善生殖等藥理活性[2-8]。巴戟天含糖量大，生品總糖可達(dá)50%以上，且多集中于皮部[9]，其中，寡糖已被證明具有抗抑郁、促進(jìn)小鼠精子生長、提高免疫等作用[2-5]。

巴戟天Morindae Officinalis Radix（MOR）始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，歷代本草均有記載。唐代《銀海精微》中最早見有“酒浸一宿，去皮心”的記載[10]；《雷公炮炙論》也記載了“凡使須用枸杞子湯浸一宿，待稍軟漉出，卻用酒浸一伏時(shí)，又漉出…”[11]，開始將酒制等方法引入巴戟天的炮制中；明清時(shí)期酒制（如酒浸、酒焙等）的應(yīng)用尤為突出?，F(xiàn)今，雖然1990年版至2020年版《中國藥典》主要收載了巴戟天、巴戟肉、鹽巴戟天和制巴戟天4個(gè)品種，未收載酒巴戟天。但在中國部分地區(qū)仍有應(yīng)用酒巴戟天，且已收載于地方中藥材炮制規(guī)范中，如《廣東省中藥飲片炮制規(guī)范》（第一冊）。傳統(tǒng)的酒炙法是加入黃酒悶潤一段時(shí)間后在鍋中炒干，炒制的火力和時(shí)間等全憑操作工的炮制經(jīng)驗(yàn)而定，具體炮制工藝參數(shù)難以量化[12]。酒能行能散，可以通經(jīng)活絡(luò)，藥物經(jīng)過酒炙后能緩和其寒性、引導(dǎo)藥物直達(dá)病所；而且酒炙后的藥材入湯劑，其有效成分易于煎出。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，炮制方法不同，巴戟天中寡糖類成分含量也有所不同，其中，生巴戟天中寡糖含量與炮制品相比較少[13]。而巴戟天是否需要酒炙？酒炙后寡糖類成分含量是否增加、能否增強(qiáng)巴戟天“溫腎助陽”的作用？國內(nèi)外尚未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖4種寡糖成分的總含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合熵權(quán)法逼近理想解排序法（technique for order of preference by similarity to ideal solution，TOPSIS）篩選酒炙巴戟天的工藝參數(shù)，并比較其酒炙前后對(duì)環(huán)磷酰胺所致生精障礙的雄性小鼠生殖氧化應(yīng)激的影響，為巴戟天酒炙提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

巴戟天藥材來源于廣東德慶縣高良鎮(zhèn)巴戟天種植基地，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)的丁平研究員鑒定為茜草科巴戟天屬植物巴戟天M.officinalisHow的干燥根。對(duì)照品蔗糖（批號(hào)為S02S6G1）、1-蔗果三糖（批號(hào)為AWG0714）、耐斯糖（批號(hào)為Z17A9H59088）、1F-果呋喃糖基耐斯糖（批號(hào)為S09A8D41431）均購于上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%。乙腈，色譜純，美國ACS化學(xué)試劑公司；三乙胺，色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醇，分析純，天津大茂化學(xué)試劑有限公司；黃酒，批號(hào)為20190815，紹興市乾升酒業(yè)有限責(zé)任公司；水為去離子水、生理鹽水，石家莊四藥有限公司；伊紅染料，阿拉丁試劑（上海）有限公司；注射用環(huán)磷酰胺，德國Baxter Oncology GmbH公司，批號(hào)9F312A；維生素E，批號(hào)S12201001210，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（批號(hào)為20191209）、丙二醛試劑盒（批號(hào)為20191218）、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（可見光法）（批號(hào)為20191214）均購于南京建成生物工程研究所；一次性無菌注射器，岳陽明康醫(yī)用材料有限公司；凍存管，南通云程實(shí)驗(yàn)器材有限公司；托盤，組織剪，眼科剪，鑷子等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM雄性小鼠，體質(zhì)量（20±2）g。廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（粵）2018-0085。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循廣州中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.3 儀器

Hitachi Primaide高效液相色譜儀，包括1110泵，1210自動(dòng)進(jìn)樣器，1310柱溫箱，日本日立高新技術(shù)公司；UM5800蒸發(fā)光散射檢測器，上海通微分析技術(shù)有限公司；XR 205 SM-DR電子分析天平，精度＝0.01 mg，瑞士Precisa公司；電子分析天平，精度＝0.1 mg，瑞士Sartorius公司；DFT-200高速萬能粉碎機(jī)，25 000 r/min，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；CQ-200超聲波清洗器，功率200 W，頻率40 kHz，上海音波聲電科技公司；Eclipse TE2000-5倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司；BC-2800Vet全自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；CT14RD低速冷凍離心機(jī)，天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；1510全波長酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific公司；Eppendorf（德國）移液槍等。

2 方法與結(jié)果

2.1 巴戟天酒炙工藝

取100 g生巴戟天藥材，加定量黃酒拌勻，悶潤一定的時(shí)間，置炒制容器中炒制一定的時(shí)間，取出，烘干。取已炮制好的酒巴戟天，除雜，用高速打粉機(jī)粉碎，過50目篩，備用。

2.2 4種指標(biāo)成分含量測定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖對(duì)照品適量，精密稱定，加入60%乙腈超聲溶解，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，最終質(zhì)量濃度分別為蔗糖1.220 mg/mL、1-蔗果三糖0.610 mg/mL、耐斯糖1.508 mg/mL、1F-果呋喃糖基耐斯糖1.599 mg/mL。

2.2.2 供試品溶液的制備 取巴戟天生品及每個(gè)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)組酒炙巴戟天樣品0.5 g，平行3份，精密稱定質(zhì)量，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 50%乙醇，稱定質(zhì)量，靜置30 min后，再超聲提取20 min，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置10 min，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為Waters XBridgeTMAmide柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相為0.2%三乙胺乙腈溶液（A）-0.2%三乙胺水溶液（B），梯度洗脫程序：0～10 min，75%～70% A；10～20 min，70% A；20～45 min，70%～60% A；45～60 min，60% A；60～63 min，60%～75% A；63～75 min，75% A；體積流量0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）漂移管溫度75 ℃；氮?dú)饬髁?.0 L/min；柱溫35 ℃。混合對(duì)照品、生巴戟天藥材和酒巴戟天藥材的HPLC-ELSD圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品 (A)、生巴戟天藥材 (B) 和酒巴戟天藥材(C) 的HPLC-ELSD圖Fig.1 HPLC-ELSD of mixed reference substances (A),MOR samples of raw (B) and stir-frying with yellow wine (C)

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加50%乙醇定容至5 mL，配制成一系列不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，以各對(duì)照品峰面積（A）積分值的對(duì)數(shù)值（Y）對(duì)各進(jìn)樣質(zhì)量（μg）的對(duì)數(shù)值（X）進(jìn)行線性回歸，得到各指標(biāo)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍分別為蔗糖Y＝1.463 4X＋2.204 4，r＝0.999 6，2.44～24.40 μg；1-蔗果三糖Y＝1.460 7X＋2.153 7，r＝0.999 7，1.22～12.20 μg；耐斯糖Y＝1.514 0X＋1.972 4，r＝0.999 5，3.02～30.16 μg；1F-果呋喃糖基耐斯糖Y＝1.530 0X＋ 1.746 1，r＝0.999 5，3.20～31.98 μg。

2.2.5 檢測限和定量限 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加60%乙腈不斷稀釋后進(jìn)樣測定，檢測限依據(jù)3倍噪音的峰響應(yīng)值（信噪比為3∶1）和稱樣量計(jì)算，定量限依據(jù)10倍噪音的峰響應(yīng)值（信噪比為10∶1）和稱樣量計(jì)算。結(jié)果各指標(biāo)的檢測限、定量限分別為蔗糖0.022、0.050 μg，1-蔗果三糖0.028、0.062 μg，耐斯糖0.024、0.053 μg，1F-果呋喃糖基耐斯糖0.043、0.096 μg。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取生巴戟天供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的峰面積RSD分別為3.13%、2.37%、1.91%、1.94%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取生巴戟天供試品溶液，在制備后0、2.5、5、7.5、10、12.5、24、48、72 h分別進(jìn)樣20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測得蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的峰面積RSD分別為2.43%、1.77%、2.03%、2.98%，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批生巴戟天藥材粉末6份，每份0.5 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測得蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為2.67%、2.22%、2.34%、2.20%，表明該制備方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測定指標(biāo)成分含量的同一批生巴戟天粉末9份，每份0.25 g，分別精密加入對(duì)應(yīng)量的蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖，每一質(zhì)量濃度平行3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，并按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測得蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的平均加樣回收率分別為101.00%（RSD為2.01%）、101.69%（RSD為1.92%）、99.79%（RSD為2.36%）、101.29%（RSD為1.78%）。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化酒炙巴戟天工藝

基于《廣東省中藥材炮制規(guī)范》（第一冊）[14]，按L16(45)正交試驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)研究巴戟天酒炙的最佳工藝參數(shù)。選用黃酒用量（A）、悶潤時(shí)間（B）、炒制溫度（C）、炒制時(shí)間（D）、烘干時(shí)間（E）為考察因素，每個(gè)因素?cái)M定4個(gè)水平（表1）。以蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖共4種寡糖總量為指標(biāo)，利用熵權(quán)法確定各成分含量的權(quán)重比，具體計(jì)算步驟參考文獻(xiàn)方法[15]，即蔗糖含量占21.01%、1-蔗果三糖含量占22.17%、耐斯糖含量占27.70%、1F-果呋喃糖基耐斯糖含量占29.13%。各指標(biāo)含量按照權(quán)重相加得分即為綜合得分，總得分越高越好。正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2。由方差分析結(jié)果可以看出（表2），因素A和D對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有顯著性影響（P＜0.05），因素C對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有極顯著性影響（P＜0.01），因素B和E對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。由極值R可知（表1），各因素作用的大小順序?yàn)镃＞D＞A＞E＞B，表明黃酒用量（因素A）、炒制溫度（因素C）和炒制時(shí)間（因素D）均對(duì)巴戟天中4種寡糖成分有較大影響，其中炒制溫度（因素C）對(duì)其影響最大。按照綜合得分越大越好的原則，最佳組合為S11號(hào)A3B3C1D2E4組合最佳，其蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量分別高于其他組合中的4種寡糖的含量。該結(jié)果表明，巴戟天藥材經(jīng)酒炙可促進(jìn)其糖類成分的溶出，隨著溫度的升高和時(shí)間的延長，大分子糖類化合物受熱分解生成小分子糖類化合物（如單糖和寡糖）。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及結(jié)果 (n = 3)Table 1 Design and results of orthogonal test (n = 3)

表2 方差分析結(jié)果Table 2 Analysis of variance

2.4 熵權(quán)TOPSIS模型計(jì)算結(jié)果和聚類分析

采用Excel 2010版軟件進(jìn)行熵權(quán)TOPSIS模型計(jì)算。建模方法參考文獻(xiàn)報(bào)道[15]，本實(shí)驗(yàn)建立初始化（6×17）決策矩陣、歸一化決策矩陣、加權(quán)決策矩陣，對(duì)生巴戟天和16批酒巴戟天正交組進(jìn)行熵權(quán)TOPSIS模型分析，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)排序，如表3評(píng)分結(jié)果所示，巴戟天最佳炮制工藝為S11號(hào)A3B3C1D2E4組合，即100 g生巴戟天加入20 mL的黃酒，悶潤2 h，炒制溫度為60 ℃，炒制7 min后置于50 ℃烘箱烘1 h，與方差分析結(jié)果一致。

表3 生巴戟天和16批酒巴戟天正交組熵權(quán)TOPSIS模型分析Table 3 Analysis of entropy weight TOPSIS model for raw and 16 orthogonal groups of MOR

采用SPSS 22.0軟件對(duì)生巴戟天及16批酒巴戟天正交組進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖2所示，所有樣品可聚為2大類，生巴戟天藥材和熵權(quán)TOPSIS模型綜合評(píng)分前3的正交組聚為I類，其他組別聚為II類，該結(jié)果與熵權(quán)TOPSIS模型分析結(jié)果基本一致。表明本次實(shí)驗(yàn)所建的熵權(quán)TOPSIS模型準(zhǔn)確、可靠，可用于巴戟天酒炙工藝的篩選。

圖2 生巴戟天和16批酒巴戟天正交組的聚類分析結(jié)果Fig.2 Cluster analysis results of raw and 16 orthogonal groups of MOR

2.5 炮制工藝驗(yàn)證

根據(jù)熵權(quán)TOPSIS模型法篩選出最優(yōu)的酒巴戟天炮制工藝參數(shù)，即100 g生巴戟天加入20 mL的黃酒，悶潤2 h，炒制溫度為60 ℃，炒制7 min后置于50 ℃烘箱烘1 h。精密稱取3份生巴戟天藥材，按此工藝條件重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為62.59 mg/g（RSD為0.42%）、27.65 mg/g（RSD為1.83%）、64.78 mg/g（RSD為0.89%）、103.29 mg/g（RSD為0.53%），表明本研究篩選的炮制工藝穩(wěn)定、可行。同時(shí)，與生巴戟天比較，酒炙后蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量均有所增加，表明酒炙能提高巴戟天中的寡糖類成分的含量。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (n = 3)Table 4 Results of verification (n = 3)

2.6 對(duì)環(huán)磷酰胺所致生精障礙的雄性小鼠生殖氧化應(yīng)激的作用對(duì)比研究

生巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖的制備方法均參照本課題組前期的方法制備[16]。查閱文獻(xiàn)可知[17]，臨床上病人接受巴戟天寡糖膠囊為0.6～1.2 mg/kg，按照人和動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值設(shè)置本次實(shí)驗(yàn)的巴戟天寡糖給藥劑量。取雄性KM小鼠（20±2）g共42只，隨機(jī)分為以下7組：正常組（給予等劑量生理鹽水），模型組（給予含75 mg/kg環(huán)磷酰胺的生理鹽水溶液），陽性藥（維生素E，VE）組（同時(shí)給予75 mg/kg環(huán)磷酰胺和0.5 mg/mL的VE），生巴戟天寡糖低、高劑量（RMO50、RMO200）組，酒巴戟天寡糖低、高劑量（WMO50、WMO200）組（同時(shí)給予75 mg/kg環(huán)磷酰胺和寡糖溶液，高、低劑量分別為200、50 mg/kg）。然后于實(shí)驗(yàn)分組后當(dāng)天及第4天8:00時(shí)ip環(huán)磷酰胺，每天9:00時(shí)ig給藥1次，自由飲食，通路抑制劑每天ip 1次，每天記錄小鼠體質(zhì)量及消耗的飼料、水，飼養(yǎng)環(huán)境為相對(duì)濕度（55±5）%，室內(nèi)溫度（22±2）℃，12 h光照，每天更換1次墊料，給藥3周。

2.6.1 雄性KM小鼠血液及臟器處理 在實(shí)驗(yàn)操作前禁食12 h，稱定質(zhì)量，乙醚麻醉，摘眼球取血。吸取全血于4 ℃離心機(jī)中3000 r/min離心10 min用于生化指標(biāo)分析，然后快速解剖，取出睪丸及附睪，用預(yù)冷的生理鹽水清洗，用濾紙吸干水分，稱重。附睪用于精子參數(shù)分析，取四分之一睪丸組織用10%甲醛固定液浸泡，用于組織病理學(xué)分析。

2.6.2 巴戟天酒炙前后寡糖對(duì)模型雄性KM小鼠精子參數(shù)的影響 將左側(cè)附睪放進(jìn)新的2 mL的生理鹽水中，剪碎，在37 ℃孵育箱中孵育10 min左右，使精子充分游離出，然后吸取全部溶液，1000 r/min低速常溫離心1 min，制備精子混懸液。吸取200 μL精子混懸液，加入800 μL的生理鹽水置于6孔板中（稀釋5倍）。吸取20 μL稀釋液充滿血球計(jì)數(shù)板，將血球計(jì)數(shù)板置于光學(xué)倒置顯微鏡載物臺(tái)上（400×），計(jì)算精子總數(shù)、精子存活率及精子畸形率。結(jié)果如表5所示，與正常組相比，模型組小鼠精子總量、精子存活率和精子畸形率顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，酒巴戟天寡糖生精作用及改善精子質(zhì)量的能力明顯改善，優(yōu)于生巴戟天寡糖，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），說明酒炙后巴戟天“溫腎助陽”作用增強(qiáng)，其原因可能與酒炙使巴戟天中大分子糖類化合物水解產(chǎn)生具有較強(qiáng)生物活性的寡糖類成分有關(guān)。

表5 酒炙前后巴戟天寡糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致生精障礙雄性小鼠生殖氧化應(yīng)激的影響 ( , n = 6)Table 5 Effects of MOR oligosaccharides of raw and stir-frying with yellow wine on reproductive oxidative stress in male mice with spermatogenesis induced by cyclophosphamide ( , n = 6)

表5 酒炙前后巴戟天寡糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致生精障礙雄性小鼠生殖氧化應(yīng)激的影響 ( , n = 6)Table 5 Effects of MOR oligosaccharides of raw and stir-frying with yellow wine on reproductive oxidative stress in male mice with spermatogenesis induced by cyclophosphamide ( , n = 6)

與正常組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與RMO50和RMO200組比較：&P＜0.05#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs normal group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group; &P ＜ 0.05 vs RMO50 and RMO200 groups

組別 精子總數(shù)/(×106 mL-1) 精子存活率/% 精子畸形率/% GSH-Px/(μmol·mL-1) CAT/(U·mL-1) MDA/(nmol·mL-1)正常 2.90±0.13 85.48±5.71 8.83±2.30 646.98±96.98 8.50±1.50 3.08±1.18模型 1.35±0.13## 32.92±7.67## 65.28±10.60## 522.79±63.77# 3.32±0.58## 7.29±3.08##VE 3.34±0.60** 57.16±12.98** 46.48±2.16** 626.93±91.63* 7.57±2.68** 5.39±2.01*RMO50 0.78±0.12 35.56±13.12 60.01±0.32 534.22±115.64 8.28±1.89** 6.69±1.78 RMO200 1.45±0.15 40.26±12.78 62.84±3.76 572.85±84.54 9.07±1.93** 6.97±2.75 WMO50 4.02±0.13**& 69.15±22.86**& 37.97±2.45**& 726.17±101.92**& 7.27±0.95** 6.65±1.02 WMO200 3.98±1.05**& 62.53±14.45**& 36.67±2.93**& 568.69±126.79 8.76±1.94** 6.56±2.26

2.6.3 巴戟天酒炙前后寡糖對(duì)雄性KM小鼠睪丸組織的影響 取經(jīng)10%甲醛溶液浸泡的雄性小鼠睪丸，經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋，制備小鼠睪丸組織切片。常規(guī)HE染色，拍照。結(jié)果如圖3所示，正常組小鼠睪丸曲細(xì)精管之間排列緊密，曲精細(xì)胞內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞排列層次分明，管腔中可見成熟的精子，且精管間質(zhì)中間質(zhì)細(xì)胞較大、成群分布、發(fā)育良好，未見明顯的病理變化（圖3-A）。模型組小鼠睪丸組織生精上皮明顯變薄，生精細(xì)胞層次和數(shù)量減少，生精小管腔可見少量精子形成（圖3-B）。VE組小鼠睪丸曲精細(xì)管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞分層排列，管腔中可見成熟的精子，精管間質(zhì)中間質(zhì)細(xì)胞較大，未見明顯病理改變（圖3-C）。圖3-D～G結(jié)果顯示，生巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖，均對(duì)環(huán)磷酰胺所致的雄性KM小鼠的睪丸病理均有不同程度的改善，其中，酒巴戟天寡糖改善效果較生巴戟天寡糖改善效果好。

圖3 雄性KM小鼠睪丸病理切片顯微圖 (HE染色, ×200)Fig.3 Pathological section of testis in male mice (HE staining, × 200)

2.6.4 巴戟天酒炙前后對(duì)模型雄性KM小鼠血清中GSH-Px、CAT活性及丙二醛含量的影響 采用試劑盒法測定雄性KM小鼠血清中GSH-Px、CAT的活性及丙二醛含量。結(jié)果如表5所示，與正常組比較，模型組小鼠血清中GSH-Px、CAT活性顯著降低（P＜0.05、0.01），丙二醛含量顯著增高（P＜0.01），表明本實(shí)驗(yàn)造模成功。與模型組比較，生巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖高低劑量組小鼠中的CAT活性明顯升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），且丙二醛含量均有所降低，但無顯著性差異，酒巴戟天寡糖低劑量組的GSH-Px活性顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇

雖然文獻(xiàn)報(bào)道巴戟天中脂溶性成分（如環(huán)烯醚萜類、蒽醌類等）具有生物活性，而且也有以其為指標(biāo)進(jìn)行工藝篩選的報(bào)道[18]，但該類成分與糖類成分相比，一是在巴戟天藥材中含量相對(duì)較低，二是炮制用的黃酒乙醇量一般為15%～20%，并不利于脂溶性成分的溶出。而巴戟天中糖類成分約占藥材的50%[9]，并且文獻(xiàn)報(bào)道了寡糖是巴戟天發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)之一，具有促進(jìn)生殖、抗氧化、抗抑郁等藥理活性[4-6]?！吨袊幍洹?020年版中的巴戟天炮制品雖以耐斯糖含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)[1]，但單一成分難以全面整體地反映飲片的內(nèi)在質(zhì)量。故本研究選取結(jié)構(gòu)清晰、對(duì)照品易得的蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖共4種寡糖單體共同作為酒巴戟天炮制工藝篩選的指標(biāo)性成分。

3.2 巴戟天酒炙工藝篩選方法的比較

熵權(quán)TOPSIS模型是有限方案多目標(biāo)決策分析的一種方法，該法對(duì)樣本無特殊要求，分析簡便，采用該模型可用熵權(quán)替代經(jīng)驗(yàn)加權(quán)，有效的規(guī)避了主觀偏好性，將主觀思維嚴(yán)謹(jǐn)化[19]。因此，本實(shí)驗(yàn)引入該模型對(duì)16批酒巴戟天正交組中4種寡糖類成分含量的歸一化值進(jìn)行加權(quán)，進(jìn)而綜合篩選出巴戟天酒炙的最佳炮制工藝，該結(jié)果與正交試驗(yàn)方差分析和聚類分析結(jié)果一致，表明該模型簡便、可行，用于巴戟天酒炙工藝的篩選更具邏輯性和科學(xué)性。

3.3 藥效模型的選擇

睪丸氧化應(yīng)激損傷是男性不育的重要影響因素，環(huán)磷酰胺是一種抗腫瘤和免疫抑制類藥物，其在發(fā)揮藥效的同時(shí)，也會(huì)影響人體正常細(xì)胞的增殖與分化[20]；其中，氧化應(yīng)激損傷可能是環(huán)磷酰胺引起睪丸生精障礙的主要原因之一[21]；而且本課題組前期已證明了巴戟天寡糖具有精子保護(hù)的作用[5]。因此，為了排除巴戟天藥材粗提物中脂溶性成分、大分子糖類化合物及無機(jī)鹽離子、蛋白、色素等雜質(zhì)對(duì)藥效的影響，本研究在篩選出的最佳炮制工藝（S11組合）基礎(chǔ)上，參照課題組前期的方法[15]將生巴戟天藥材和酒巴戟天藥材中的寡糖提取與純化后，再進(jìn)行炮制前后藥效的對(duì)比研究。結(jié)果通過對(duì)巴戟天酒炙前后寡糖藥效的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，寡糖極有可能是巴戟天發(fā)揮生殖作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，即巴戟天經(jīng)過酒炙后與生品比較，4種寡糖含量均有所增高，即蔗糖約高出1.5倍、1-蔗果三糖和耐斯糖約高出1.2倍、1F-果呋喃糖基耐斯糖約高出1.1倍。少、弱、畸精子癥是生精障礙的表現(xiàn)之一，在中醫(yī)學(xué)上屬于“精寒”“精冷”等范疇，腎虛是其發(fā)病的關(guān)鍵；行不足者，溫之以氣，陽氣的溫煦不足導(dǎo)致精子畸形率的增高[22]，而巴戟天酒炙后能引導(dǎo)藥物直達(dá)病所，提高了精子總數(shù)和存活率、降低了精子畸形率，效果較生巴戟天明顯。這些結(jié)果從側(cè)面表明了酒巴戟天發(fā)揮“溫腎助陽”的作用可能與酒炙能使巴戟天中糖類成分溶出增加，在炒制過程中，受熱分解生成單糖和寡糖等化合物有關(guān)。后期，本課題組將繼續(xù)以生殖氧化應(yīng)激作用為切入點(diǎn)，深入挖掘酒炙后巴戟天“溫腎助陽”的物質(zhì)基礎(chǔ)與科學(xué)內(nèi)涵，為傳統(tǒng)中藥的炮制機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

本研究首次結(jié)合多指標(biāo)成分，采用正交-TOPSIS法優(yōu)選出巴戟天酒炙最佳炮制工藝，為巴戟天飲片的炮制工藝篩選、開發(fā)利用及炮制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考；比較酒炙前后巴戟天寡糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致的生精障礙雄性小鼠生殖氧化應(yīng)激作用，為巴戟天酒炙的合理性和有效性提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突