基于指紋圖譜和網絡藥理學對經典名方竹茹湯中葛根的質量標志物（QMarker）預測分析

王 璐，張禮欣，賈奧蒙，毛春芹，李 林，侯金才，郭 勇，陸兔林*，申屠銀洪

1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023

2.神威藥業集團有限公司，河北 石家莊 051430

3.浙江桐君堂中藥飲片有限公司，浙江 桐廬 311500

竹茹湯（Zhuru Decoction，ZRD）出自宋朝許叔微的《普濟本事方》卷第四·翻胃嘔吐霍亂·竹茹湯，原方由葛根、甘草、半夏、竹茹、生姜、大棗6味藥組成，主治胃熱嘔吐，其后經歷藥味組成、劑量和功效主治等方面的改變，還可用于治療酒嘔。方中重用葛根，清胃生津，是為君藥；半夏、竹茹、生姜和胃止嘔；甘草、大棗健脾益氣，調和諸藥[1-2]。

葛根Puerariae Lobatae Radix（PLR）來源于豆科葛屬植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi的干燥根[3]，味甘、辛，涼，能解肌退熱、生津止渴、解酒毒。用于外感發熱頭痛、口渴、酒毒傷中。據報道[4]，葛根水提物能縮短小鼠醉后睡眠時間，加速酒精在肝臟中代謝速度，降低肝損傷的風險，另有研究[5]證明葛根中黃酮和葛根素等成分可通過調節酒精和脂質代謝減輕斑馬魚酒精性肝損傷。葛根除胃熱、解酒的作用與竹茹湯和胃止嘔、治療酒嘔的功效相一致，此外，葛根被廣泛應用于心腦血管疾病和免疫系統疾病的臨床治療[6]。

為提升中藥及產品質量標準，對現有質量評價與控制方法及存在問題進行研究分析后，劉昌孝院士[7]于2016年提出了中藥質量標志物（Q-Marker）的概念，后經張鐵軍等[8]總結歸納得出中藥質量標志物應符合有效、特有、傳遞與溯源、可測和處方配伍的“五原則”，現如今預測中藥Q-Marker多遵循此五原則。

中藥及其復方制劑成分復雜，質量難以控制，Q-Marker的建立有利于中藥全程質量控制及質量溯源，是中藥質量評價與控制的指標。中藥指紋圖譜能充分反應中藥化學成分的傳遞和溯源，網絡藥理學則是近幾年興起的基于成分-靶點-通路-疾病科學地對中藥藥效進行預測的一種手段，也能從理論上闡明中藥的有效性，指紋圖譜結合網絡藥理學適用于中藥多成分、多靶點、多通路的特點。本課題組基于Q-Marker理論，通過指紋圖譜和網絡藥理學的研究方法，以“Q-Marker五原則”為核心，預測經典名方竹茹湯中葛根的Q-Marker，以期為經典名方中單味藥的Q-Marker研究提供借鑒，同時為全面控制經典名方竹茹湯奠定基礎，為進一步研制竹茹湯相關制劑及其質量控制提供思路[9-12]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，DAD紫外檢測器，Chem Station色譜工作站，安捷倫科技有限公司；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FA1104N電子天平，d＝0.1 mg，上海菁海儀器有限公司；MS-105D電子天平，d＝0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多集團；H1650-W臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；ZYX0071超純水系統，南京漢隆實驗器材有限公司；MGH21S011紅外爐，廣東美的生活電器制造有限公司。

1.2 試藥

對照品葛根素，批號110752-201615，質量分數95.4%，購自中國食品藥品檢定研究院；對照品3′-羥基葛根素（批號180102，質量分數≥98%）、3′-甲氧基葛根素（批號171204，質量分數≥98%）、葛根素芹菜糖苷（批號171216，質量分數≥98%）均購自南京森貝伽生物科技有限公司；對照品大豆苷（批號20111016，質量分數≥98%）、大豆苷元（批號YY20101110，質量分數≥98%）均購自上海源葉生物技術有限公司。甲醇，分析純，山東禹王實業有限公司化工分公司；乙腈，色譜純，默克股份兩合公司；甲酸，色譜純，美國恩科公司；水為娃哈哈純凈水。

竹茹湯由葛根、甘草、半夏、竹茹、生姜和大棗6味藥組成，均購自道地產區或主產區，經南京中醫藥大學藥學院陳建偉教授鑒定。每味藥共收集多個產地，總批次不少于15批，均明確了各藥材基原、藥用部位、產地及其采收加工方法。本課題組前期已按照《中國藥典》2020年版項下各味藥的檢測方法和要求對藥材進行檢測，合格的優質藥材按照《中國藥典》2020年版項下炮制方法及經典名方申報資料要求擬定的飲片草案，將藥材炮制成合格飲片。

本實驗共研究15批葛根藥材水煎液、15批葛根飲片水煎液以及15批不同批次飲片及3批同批次飲片制備的共18批竹茹湯，其中葛根來自陜西、安徽、河南3個產地共15批，為豆科葛屬植物野葛P.lobata(Willd.) Ohwi的干燥根；半夏來自江蘇泰州、甘肅天水、貴州3個產地共15批，為天南星科半夏屬植物半夏Pinellia ternata(Thunb.) Breit.的干燥塊莖；甘草來自新疆阿勒泰、內蒙鄂爾多斯、甘肅隴西3個產地共15批，為豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖；竹茹來自江西、四川2個產地共15批，為禾本科剛竹屬植物淡竹Phyllostachys nigra(Lodd.) Munro var.henonis(Mitf.) Stapf ex Rendle的莖稈的干燥中間層；生姜來自山東、云南2個產地共15批，為姜科姜屬植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鮮根莖；大棗來自山東新泰、河北滄州、山西聞喜3個產地共15批，為鼠李科棗屬植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實。藥材及對應飲片來源與批號見表1。

表1 藥材及對應飲片來源與批號Table 1 Source and batch number of medicinal materials and decoction pieces

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脫：0～4 min，0.5%～8%乙腈；4～25 min，8%～10%乙腈；25～36 min，10%乙腈；36～38 min，10%～14%乙腈；38～55 min，14%～16%乙腈；55～60 min，16%～23%乙腈；60～70 min，23%～30%乙腈；70～85 min，30%～75%乙腈；85～89 min，75%～100%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取各對照品適量，加50%甲醇配制成含3′-羥基葛根素88.11 μg/mL、葛根素285.14 μg/mL、3′-甲氧基葛根素92.57 μg/mL、葛根芹菜糖苷114.97 μg/mL、大豆苷86.74 μg/mL、大豆苷元57.49 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

本課題組前期已對竹茹湯基準樣品的制備方法、工藝參數進行了考察，按照經典名方申報資料要求隨機組合多批次，采用確定的煎煮方法得到15批葛根藥材水煎液（編號YC1～YC15）、15批葛根飲片水煎液（編號YP1～YP15）和18批竹茹湯（編號ZRD1～ZRD18）和1批缺葛根陰性水煎液（編號YX）。分別取上述液體30 mL于蒸發皿水浴揮干，50%甲醇復溶，定容至10 mL量瓶中，離心，過0.22 μm微孔濾膜即得。

2.4 葛根藥材、飲片水煎液及竹茹湯指紋圖譜研究

2.4.1 精密度試驗 取ZRD供試品溶液，重復進樣6次，記錄指紋色譜圖。選擇保留時間穩定、面積大的葛根素色譜峰作為參照峰，各個共有峰的相對保留時間RSD值均小于0.13%，相對峰面積RSD值均小于4.42%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取平行制備的ZRD供試品溶液6份，在上述色譜條件下進樣，記錄指紋色譜圖。以葛根素為參照峰，各個共有峰的相對保留時間RSD值均小于0.12%，相對峰面積RSD值均小于4.97%，表明該方法的重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取ZRD供試品溶液，分別室溫放置0、2、4、8、12、24 h后，在上述色譜條件下進樣，記錄指紋色譜圖。以葛根素為參照峰，各個共有峰的相對保留時間RSD值均小于0.12%，相對峰面積RSD值均小于4.82%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.4 指紋圖譜的建立 將15批葛根藥材水煎液、15批葛根飲片水煎液及18批竹茹湯基準樣品供試品溶液分別進樣測定，將圖譜以AIA格式保存，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）。以S1圖譜作為參照譜，采用中位數法，進行多點校正和色譜峰匹配，15批葛根藥材水煎液、葛根飲片水煎液均分別得到了21個共有峰，18批竹茹湯基準樣品得到了25個共有峰，15批葛根藥材水煎液、葛根飲片水煎液以及18批竹茹湯基準樣品的指紋圖譜疊加圖分別見圖1～3。

圖1 15批葛根藥材水煎液指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 15 batches of PLR decoction

2.4.5 相似度分析 將15批葛根藥材、飲片水煎液和18批竹茹湯的指紋圖譜均導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2012年版），計算相似度，結果15批葛根藥材水煎液（編號YC1～YC15）的相似度分別為0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000；15批葛根飲片水煎液（編號YP1～YP15）的相似度分別為0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000；18批竹茹湯（編號ZRD1～ZRD18）的相似度分別為0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、1.000、0.999、1.000、0.999、0.999、1.000、1.000、1.000、0.999、0.999；可見，15批葛根藥材、15批葛根飲片水煎液和18批竹茹湯的指紋圖譜相似度均＞0.95，表明葛根藥材、飲片水煎液和竹茹湯的質量穩定均一。

圖2 15批葛根飲片水煎液指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 15 batches of PLR pieces decoction

圖3 18批竹茹湯指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of 18 batches of ZRD

2.4.6 共有峰的指認及相關分析 根據指紋圖譜分析結果，將多批次葛根藥材水煎液、葛根飲片水煎液、竹茹湯指紋圖譜共有模式、缺葛根陰性水煎液和混合對照品的指紋圖譜進行疊加。采用對照品比對的方式，指認了葛根藥材、飲片水煎液及竹茹湯指紋圖譜共有模式中的6個共有峰，分別為3′-羥基葛根素（4號峰）、葛根素（6號峰）、3′-甲氧基葛根素（7號峰）、葛根芹菜糖苷（9號峰）、大豆苷（11號峰）、大豆苷元（23號峰），且這6個峰在竹茹湯中無陰性干擾，見圖4。

圖4 竹茹湯、葛根藥材、葛根飲片水煎液指紋圖譜共有模式圖和混合對照品、缺葛根陰性水煎液色譜圖Fig.4 Fingerprints of ZRD, PLR decoction, PLR pieces decoction and chromatograms of mixed control substance and negative decoction of PLR pieces

對15批葛根藥材水煎液、飲片水煎液指紋圖譜相似度計算，各產地葛根指紋圖譜相似度均大于0.95，說明不同產地間葛根藥材及飲片的整體化學組分類似，且與復方共有6個特征性成分，由此看出葛根中這6個成分實現了“藥材-飲片-復方”的傳遞，具有良好的傳遞與溯源性，且在配伍處方中也能得到較好的指認，以此為基礎將篩選出的竹茹湯中葛根的6個活性成分進一步進行網絡藥理學研究，選取的這6個成分均在指紋圖譜中響應值前10，且根據前期文獻研究推測可能與竹茹湯治療胃熱嘔吐、解酒嘔的功效關聯性更為密切。

2.5 基于成分-靶點-通路的網絡藥理學分析

2.5.1 候選化合物靶點預測 檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），獲取3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元6個化合物的靶點信息；通過PubChem Compound數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）進行搜索，將得到的化合物SMILES結構輸入Swiss Target Prediction服務器（http://new.swisstargetprediction.ch/）進行靶點預測，并結合TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數據庫，得到上述6個化合物的作用靶點，篩去重復靶點，最終得到與其有關的作用靶點共159個。

2.5.2 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）網絡構建 PPI能夠體現蛋白靶點彼此之間的相互作用，這些作用包括參與傳遞生物信號、調節基因表達、調控能量和物質代謝及細胞周期等。對6個化合物的靶點相互作用進行分析篩選，能夠辨識與竹茹湯功效關聯更加密切的成分，進一步確證復方中葛根的Q-Marker。將篩選出的159個靶點，導入在線STRING 11.0數據庫軟件（https://string-db.org/cgi/input.pl）進行PPI網絡分析，選擇物種為“Homo sapiens”，蛋白交互參數評分值為“high confidence＞0.9”，隱藏網絡中無聯系的節點，其余參數設置不變，獲得核心靶點PPI網絡圖（圖5），結果共獲得159個節點，421條邊。將PPI結果以TSV文本格式導入Cytoscape 3.7.1軟件中，并利用Cytoscape 3.7.1軟件中的“Network Analyzer”功能對PPI網絡進行拓撲屬性分析，計算選取度值（degree）、介數中心性（betweenness centrality）和接近中心性（closeness centrality）3個重要拓撲參數均大于中位數且度值≥15的靶點作為核心靶點。經篩選得到14個核心靶點，結果見表2。經分析發現，這14個靶點9個與大豆苷元相關、7個與葛根素相關、3個與大豆苷相關。

表2 核心靶點網絡的拓撲學性質Table 2 Topological properties of core targets network

圖5 作用靶點PPI網絡圖Fig.5 PPI network diagram of targets

2.5.3 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用David 6.8數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對14個潛在的核心靶點進行GO功能分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析主要包括基因產物細胞功能、分子功能和生物功能分析，對基因進行注釋和分類；KEGG通路富集分析可以得到竹茹湯中葛根核心靶點的信號通路。GO和KEGG分析均選取P＜0.05，具有統計學意義。

GO富集分析共獲取78個條目，其中生物過程（biological process，BP）占54個，分子功能（molecular function，MF）占20個，細胞組成（cellular component，CC）占4個，設置P＜0.05，錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.05，選取顯著性程度前20的條目進行展示，結果見圖6。結果顯示，以上靶點參與的生物過程包括RNA聚合酶II啟動子轉錄的正負調控、一氧化氮生物合成過程的正調控、平滑肌細胞增殖的正調控、轉錄正調控、核染色質、相同蛋白質結合、酶結合、轉錄因子結合、染色質結合等分子功能，推測竹茹湯中葛根通過這些功能調控機體，解熱止嘔。

圖6 GO富集分析 (前20條)Fig.6 GO analysis of number of genes (top 20)

KEGG富集分析共得到75條通路，根據顯著性程度P＜0.01，篩選得到43條相關通路，其中排名前20的通路如圖7所示，主要包括乙型肝炎、癌癥通路、HIF-1信號通路、炎癥性腸病、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路等。

圖7 KEGG富集分析Fig.7 Enrichment analysis results of KEGG

2.5.4 成分-靶點-通路網絡構建 根據篩選得到的6個成分、159個靶點和20條關鍵通路，運用Cytoscape 3.7.1軟件構建成分-靶點-通路網絡圖，結果見圖8。根據Cytoscape 3.7.1軟件對網絡圖進行分析，以成分、靶點、信號通路的度值為參考，發現大豆苷元、葛根素、大豆苷的連接度相對較高，可能是竹茹湯中葛根發揮治療胃熱嘔吐、酒嘔功效的活性物質；轉錄因子p65（transcription factor p65，RELA）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-α serine/threonine-protein kinase，AKT1）、TNF、信號轉導和轉錄激活因子1-α/β（signal transducer and activator of transcription 1-α/β，STAT1）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、STAT3、轉錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、細胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）9個靶點的連接度較高（度值≥10），可能是竹茹湯中葛根發揮作用的關鍵靶點；20條信號通路中除Pathways in cancer（度值＝11）、Hepatitis B（度值＝9）略高，NOD-like receptor signaling pathway（度值＝5）略低外，其余差異不大，因此，20條信號通路均可能是竹茹湯中葛根的關鍵信號通路。

圖8 “成分-靶點-通路”網絡圖Fig.8 “Compound-target-pathway” network diagram

2.6 整合分析

本研究通過建立葛根藥材、飲片水煎液和竹茹湯的指紋圖譜，指認其共有峰，并對指認出的成分進行網絡藥理學分析，篩選得到竹茹湯中葛根的核心靶點和信號通路，運用Cytoscape 3.7.1軟件構建成分-靶點-通路網絡圖，根據度值分析得出結論：大豆苷元、葛根素、大豆苷3個成分可能是竹茹湯中葛根發揮治療胃熱嘔吐、酒嘔功效的活性成分。朱衛豐等[13]基于Q-Marker的新概念從成分特有性、傳統功效、傳統藥性、成分可測性、中藥配伍環境（藥對配伍、復方配伍、經典方配伍）、成分有效性等多個方面對單味藥葛根的Q-Marker進行了深入全面的探討分析，大豆苷元、葛根素、大豆苷在傳統功效、成分可測性、成分有效性這3個方面均有顯著的Q-Marker特性。基于Q-Marker的五原則進行分析，這3個成分在竹茹湯中從藥材-飲片-復方均能實現良好的傳遞與溯源，且在復方中無陰性干擾，為葛根所特有，網絡藥理學從理論上證明了其有效性，綜上結合指紋圖譜和網絡藥理學對竹茹湯中葛根的Q-Marker進行預測分析，大豆苷元、葛根素、大豆苷這3個成分基本符合Q-Marker五原則，故預測其為竹茹湯中葛根潛在的Q-Marker。

3 討論

本研究依據劉昌孝院士[7]提出的Q-Marker理念，采用指紋圖譜和網絡藥理學相結合的方法分析預測竹茹湯中葛根發揮治療胃熱嘔吐功效的QMarker。通過建立葛根藥材、飲片水煎液和竹茹湯的指紋圖譜從傳遞和溯源性、可測性的角度對葛根進行分析，指認出3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元6個成分，從Q-Marker特有性的角度進行分析，這6個成分均是竹茹湯中葛根的特有成分，方中無其他藥味干擾。

運用網絡藥理學從有效性的角度對其進行分析，發現大豆苷元、葛根素、大豆苷3個活性成分通過調控RELA、AKT1、TNF、STAT1、IL-6、MAPK14、STAT3、JUN、TP53、組蛋白乙酰轉移酶p300（histone acetyltransferase p300，EP300）、表皮生長因子受體 erbB1（epidermal growth factor receptor erbB1，EGFR）等關鍵靶點，作用于Interleukin-6、TNF信號通路、NOD樣受體（NODlike receptor）信號通路、Toll樣受體（Toll-like receptor）信號通路等關鍵信號通路發揮竹茹湯治療胃熱嘔吐、酒嘔的功效。

葛根主要含有異黃酮類、三萜類、皂苷類和多糖類，含量最多的成分為異黃酮類物質，主要包括大豆苷、大豆苷元與葛根素等，其中葛根素含量占比最大[14]。葛根素能夠顯著改善高脂誘導的糖尿病小鼠抑郁癥狀、對心血管、腦部、肝臟損傷均具有保護作用[15]，大豆苷作為中藥中天然的抗酒精成癮劑，有研究以此為線索改進了編碼線粒體醛脫氫酶（ALDH2）的設計，而ALDH2非活性變異形式的ALDH2*2基因幾乎保護了該基因的所有載體免受酒精中毒的侵害[16]。大豆苷元是一種從植物中提取的次生代謝物，具有類黃酮結構，以其對胃腸道疾病的保護作用而聞名，研究表明大豆苷元對動物模型中食管反流引起的食道黏膜損傷具有預防作用[17]。

14個核心靶點中EGFR是一種跨膜糖蛋白，屬蛋白激酶家族的成員，具有誘導受體二聚和酪氨酸自磷酸化并導致細胞增殖。這個基因的突變與原發性乳腺癌發生、生長及轉移有關[18]，有文獻報道EGFR可能在葛根解熱功效中發揮重要作用[19]。IL-6是一種有效的急性反應誘導劑，在感染和組織損傷期間，IL-6的快速生成有助于宿主防御，TNF主要由巨噬細胞分泌，是引起發熱的有效熱原，在一定條件下可刺激細胞增殖和誘導細胞分化，最新研究發現，IL-6與TNF在眾多中藥抗酒精性胃損傷機制中起到關鍵作用[20]。

由此可推測，竹茹湯中葛根的活性成分可能通過作用于這些蛋白靶點起到治療胃熱嘔吐、酒嘔的療效。葛根可能通過調控HIF-1信號等7條代謝通路起到解熱的作用[19]。高思佳等[21]研究發現IL-6、TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路等10條通路參與葛根解肌退熱，部分通路與炎癥反應相關，因此推測竹茹湯中葛根治療胃熱嘔吐的機制，可能是通過相關靶點作用于這些信號通路。

綜上所述，初步預測大豆苷元、葛根素、大豆苷為竹茹湯中葛根潛在的Q-Marker。竹茹湯具有多成分、多靶點、多途徑協同作用的特點，本研究采用現代網絡藥理學方法，預測竹茹湯中君藥葛根與復方功能主治密切相關的關鍵靶點及信號通路，為進一步實驗驗證、潛在藥理學機制及臨床拓展應用提供參考依據。本研究基于中藥化學與中藥藥理學，整合多學科技術方法，基于可測性、可追溯性、有效性開展竹茹湯中葛根Q-Marker的系統辨識與確認，為后期深入研究葛根及其相關復方的作用機制提供參考，有助于建立全程質量控制體系，提高中藥產業質量控制水平[22]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突