miR-146a-5p基因多態性與多囊卵巢綜合征發病風險的相關性

王 偉， 張翠云， 李金英， 宮月嬌， 康曉靜

(秦皇島市工人醫院1.婦產科，2.內科, 3.超聲科，河北省秦皇島市 066200)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種復雜異質性的內分泌疾病，占生育年齡婦女的5%～10%，其特征是慢性無排卵、多囊卵巢和高雄激素血癥[1-3]。PCOS的病因尚不明確，其發病機制可能是環境因素與遺傳因素相互作用的結果。根據以往的研究，miRNAs參與了包括細胞增殖、分化、凋亡、代謝等過程[4-5]。因此，miRNAs在控制生殖內分泌中可能起重要作用，尤其是在卵泡形成和卵母細胞成熟過程中起作用[6]。miR-146a位于人的第5號染色體上，在人體分泌代謝中發揮核心作用[7]。相對健康女性，PCOS患者中miR-146a的表達水平顯著增加[8]。Pre-miRNA的某些多態性會影響成熟miRNA的表達或生物學功能發生變化，顯示miR-146a-5p基因多態性與多種腫瘤的進展關系密切[9]。miR-146a在PCOS患者的血漿、卵泡液和顆粒細胞中被上調[10]，提示miR-146a與PCOS存在一定關系，鑒定其基因多態性有助于闡明疾病的發病機制。本研究旨在探討miR-146a-5p基因多態性與PCOS發病風險的關系，以期為PCOS患者臨床治療提供遺傳學依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2018年6月—2019年12月本院婦科確診為多囊卵巢綜合征患者122例作為觀察組，年齡22～39歲，平均(27.9±4.7)歲。PCOS的診斷采用2003年鹿特丹診斷標準：①稀發排卵或無排卵；②高雄激素的臨床表現和(或)高雄激素血癥；③PCO超聲提示：一側或雙側卵巢直徑2～9 mm的卵泡≥12個，和(或)卵巢體積≥10 mL。符合以上2條即可診斷為PCOS，排除其他高雄多囊卵巢綜合征疾病如先天性腎上腺皮質增生、分泌雄激素的腫瘤、柯興氏綜合征等。選取同期本院體檢正常者110例作為對照組，年齡20～38歲，平均(28.5±4.8)歲。對照組納入標準：正常月經周期；內分泌值正常；經陰超檢查正常周期顯示子宮和卵巢無器質性病變，且卵巢無多囊樣表現；近3個月內未用過激素類藥物病史；排除標準：內分泌異常、高血壓、糖尿病；有糖尿病家族史。兩組研究對象在年齡、身高比較差異無顯著性(P>0.05)，具有可比性。

1.2 基因組DNA提取

研究對象提供外周靜脈血標本后，即刻置于真空抗凝釆血管內，顛倒混勻防止凝血。采用EDTA抗凝處理，提取血液基因組DNA，血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.3 多態性檢測

從生物信息學數據庫中選擇候選基因位點rs2910164，引物和探針由上海生工生物科技有限公司合成。引物序列：上游引物：5′-TCTACCATACACATCCCCTACA-3′，下游引物：5′-CACACTCCTTATACCTTACGAGC-3′。探針序列：G allele：5′-GTTGTGTCAGTGTCAGACGTC-3′，C allele：5′-CCAGCTGAA GAACTGAATTTGAC-3′。PCR反應體系為20 μL，包括5 μL 10×buffer，8 μL ddH2O，50 mg/L的DNA模板2.0 μL，2 mmol/L脫氧三磷酸核糖核苷(d NTP)2.5 μL，引物(1×10-5mol/L)各1.0 μL和0.5 μL rTaq酶。反應條件：預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃30 s，退火60 ℃30 s，延伸72 ℃ 30 s，共35個循環，終止72 ℃ 10 min。對PCR產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，溴化乙錠染色，分析基因型。

1.4 統計學方法

應用SPSS 20.0軟件處理數據，計量資料采用獨立樣本獨立t檢驗。各組間基因型頻率和等位基因頻率分布差異均采用χ2檢驗。P<0.05表示差異基因型有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組基本臨床資料比較

觀察組體質量、BMI高于對照組(P<0.05)；兩組年齡、身高差異無顯著性(P>0.05；表1)。

表1 兩組基本臨床資料比較

2.2 兩組miR-146a-5p基因型分布

觀察組和對照組miR-146a-5p的基因型分布差異有顯著性(P<0.05)；miR-146a-5p的基因型在兩組間的分布符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性(均P>0.05；表2)。

表2 兩組miR-146a-5p基因型分布 單位：例(%)

2.3 miR-146a-5p多態性與多囊卵巢綜合征發病風險之間的關系

觀察組和對照組之間的CG基因型分布存在差異(OR=2.16，95%CI為1.19～3.70，P=0.004)。觀察組中的C等位基因頻率顯著高于對照組(OR=1.78，95%CI為1.15～2.36，P=0.001)。CC+CG基因型顯著增加了PCOS的風險(OR=1.91，95%CI為1.42～2.75，P=0.001)。對年齡和BMI進行調整后，共顯性、顯性和隱性模型的基因型在OR中均未顯示任何顯著變化(表3)。

表3 兩組miR-146a-5p基因型的頻率分布

2.4 PCOS影響因素的Logistic回歸分析

以PCOS的發生風險為因變量，以體質量、BMI和miR-146a-5p基因型為自變量，進行Logistic回歸分析，miR-146a-5p rs2910164、體質量、BMI是PCOS的獨立危險因素(P<0.05；表4)。

表4 PCOS影響因素的Logistic回歸分析

3 討 論

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNP)在人類基因組中的發生核苷酸多態性頻率比較高，大約每1 000個堿基中就有一個多態位點[11]。編碼區中的SNP可能導致同義和非同義變化，非同義變化則會導致氨基酸變化或引入終止密碼子，從而可導致人類疾病，據研究預測，至少25%的非同義SNP會對蛋白質功能產生負面影響[12]。研究表明，Fetuin-A基因rs1071592多態位點與PCOS遺傳易感性存在相關性[13]。研究發現，血管內皮生長因子的rs2010963位點G/C多態性與多囊卵巢發病風險綜合征的發病風險顯著相關，攜帶C等核苷酸位基因(GC+CC)的婦女多囊卵巢綜合征患PCOS風險比GG基因多態性型較低[14]。在PCOS疾病的發生過程中可能會有一些miRNAs表達改變，在一定程度上會影響患者卵母細胞質量，可能造成不良助孕等影響[15]。rs2910164位于miR-146a前體(Pre-miR-146a)多態性序列上，堿基G/C的多態性突變可能導致miR-146a前體的莖結構從G∶U不匹配變為C∶U不匹配，可能影響成熟miR-146a的表達及對靶基因的調控功能[16]。miR-146a的rs2910164位點主要研究多態性與多種疾病的關系，miR-146a rs2910164 C等位多態性核苷酸基因可干擾pre-miR-146a與轉錄核因子的結合DNA，減少pre-miR-146a和核苷酸成熟miR-146a的表達量[17]。

研究表明，肥胖為PCOS發病的獨立危險因素[18]。miR-146a-5p可參與脂肪形成過程胰島素信號傳導途徑，通過作用多肽蛋白與胰島素受體轉氨酶在脂肪形成的過多態性基因程發揮重要作用[18]。本研究發現，兩組miR-146a-5p基因rs2910164位點均有CC、CG和GG三種基因型，等位基因頻率在兩組間的分布符合Hardy-Weinberg平衡。miR-146a-5p的rs2910164位點突變與PCOS密切相關。研究結果表明，miR-146a-5p rs2910164、體質量、BMI是PCOS的獨立危險因素。提示檢測miR-146a-5p中的rs2910164位點的多態性可以評估婦女PCOS發病風險。

綜上所述，miR-146a-5p的rs2910164位點C等位基因與PCOS發病風險增加有關，可以作為預測PCOS發病風險的潛在生物標志物。