血漿游離DNA SEPT9甲基化與結(jié)直腸癌不同病理類型的相關(guān)性

齊順利， 吳 振， 于曉倩， 趙團(tuán)結(jié)， 陳希琳， 孫 平

(1.北京市肛腸醫(yī)院 北京市二龍路醫(yī)院病理科，北京市 100010；2.博爾誠(chéng)北京科技有限公司研發(fā)部，北京市 100176；3.北京市肛腸醫(yī)院 北京市二龍路醫(yī)院肛腸科，北京市 100010)

中國(guó)結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢(shì)[1]。2018年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示：中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率、死亡率在惡性腫瘤中分別位居第3及第5位，新發(fā)病例37.6萬(wàn)，死亡病例19.1萬(wàn)。其中，城市遠(yuǎn)高于農(nóng)村，且結(jié)腸癌的發(fā)病率上升顯著[2]。多數(shù)病人在確診時(shí)已屬于中晚期[3]。甲基化的SEPT9基因可以作為CRC輔助診斷的特異性腫瘤標(biāo)志物，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于CRC的早期篩查、預(yù)后評(píng)估等[4-8]。但是對(duì)于不同的結(jié)直腸癌類型，包括組織學(xué)類型、形態(tài)類型中SEPT9的表現(xiàn)鮮有報(bào)道。本研究對(duì)SEPT9在不同病理類型、不同大體形態(tài)分型[9-10]的大腸良惡性腫瘤進(jìn)行SEPT9檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)SEPT9甲基化在結(jié)直腸癌不同組織學(xué)類型、不同大體形態(tài)分型中的陽(yáng)性檢出率。血漿游離DNA中SEPT9甲基化在結(jié)直腸癌(CRC)不同組織病理學(xué)類型、不同形態(tài)學(xué)病理類型中的檢出水平的差異，對(duì)預(yù)后監(jiān)測(cè)或分子分型具有臨床指導(dǎo)意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—7月北京市二龍路醫(yī)院病理科結(jié)直腸良惡性腫瘤209例，包括結(jié)直腸癌182例，腺瘤及神經(jīng)內(nèi)分泌瘤27例。其中結(jié)直腸良惡性腫瘤的診斷均由二龍路醫(yī)院病理科進(jìn)行病理學(xué)確認(rèn)且資料完整。結(jié)直腸癌患者的血樣采集均為術(shù)前血樣，且未經(jīng)過(guò)相關(guān)的治療。入組的209例受試者男性131例，女性78例；年齡30～83歲，平均(60.48±17.12) 歲；其中182例結(jié)直腸癌臨床分期為0期3例，Ⅰ期33例，Ⅱ期33例，Ⅲ期61例，分期不明52例。

1.2 外周血采集與血漿制備

外周血標(biāo)本的采集使用10 mL BD Vacutainera EDTA K2抗凝管，采集后立即進(jìn)行血漿制備或在2～8 ℃暫存，不超過(guò)4 h。血漿制備中，使用自然降速的離心機(jī)，1 200～1 400 r/min，離心12 min，分離出上層血漿至無(wú)菌15 mL圓錐離心管中；相同離心條件進(jìn)行二次離心，再將3.5 mL血漿移入新的15 mL圓錐底的離心管中。血漿樣本在-25～-15 ℃下保存，并在2周內(nèi)完成檢測(cè)。

1.3 DNA提取及亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化

冰凍的血漿樣本，室溫(15～30 ℃)放置融化。按照SEPT9基因甲基化檢測(cè)試劑盒(PCR熒光探針?lè)?說(shuō)明書(shū)操作，通過(guò)裂解、磁珠-DNA結(jié)合、洗滌、洗脫等步驟得到純化的血漿游離DNA(cfDNA)。cfDNA經(jīng)過(guò)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化、磁珠-DNA結(jié)合、洗滌、干燥、洗脫等步驟得到亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA(Bis DNA)。Bis DNA若不能立即使用，可2～8 ℃儲(chǔ)存24 h，或-25～-15 ℃儲(chǔ)存72 h。

1.4 SEPT9基因甲基化水平檢測(cè)

使用羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CobasZ480)，利用SEPT9基因甲基化檢測(cè)試劑盒(PCR熒光探針?lè)?博爾誠(chéng)北京科技有限公司)單次60 μL體系PCR擴(kuò)增，測(cè)定Bis DNA，從而檢測(cè)發(fā)生甲基化的SEPT9基因片段和內(nèi)參照ACTB。同時(shí)用試劑盒中陰陽(yáng)性對(duì)照品驗(yàn)證PCR反應(yīng)的有效性。所用目的基因引物序列為：SEPT9-F：5′-CCCACCAACCATCATAT-3′，SEPT9-R：5′-GTAGTAGTTAGTTTAGTAT TTATTTT-3′，SEPT9-P：5′-FAM-GTTCGAAATGATTTTATTTAGTTGC-BHQ1-3′，SEPT9擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為64 bp；ACTB-F：5′-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAG TT-3′，ACTB-R：5′-CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′，ACTB-P：5′-JOE-ACCACCACCCAACACAC AATAACAAACACA-BHQ1-3′，ACTB擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為85 bp。

PCR條件：94 ℃ 20 min；62 ℃ 5 s，55.5 ℃ 35 s，93 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；40 ℃ 5 s。當(dāng)待測(cè)樣本ACTB的Ct結(jié)果≤32.1，SEPT9的Ct≤41.0時(shí)，SEPT9基因甲基化檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；待測(cè)樣本ACTB的Ct結(jié)果≤32.1，SEPT9的Ct>41.0或無(wú)檢出(Ct無(wú)顯示)時(shí)，SEPT9基因甲基化檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果ACTB的Ct結(jié)果>32.1，說(shuō)明本次結(jié)果無(wú)效[11]。

1.5 組織樣本的免疫組織化學(xué)檢測(cè)

對(duì)CRC組織標(biāo)本切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，檢測(cè)P53的表達(dá)。采用免疫組織化學(xué)S-ABC方法[12]，對(duì)組織標(biāo)本切片經(jīng)脫蠟、水化、在檸檬酸緩沖液(0.01 mmol/L,pH 6.0)中煮沸，微波爐中加熱20 min。抗原修復(fù)后，切片在3% H2O2溶液中浸泡10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。切片用5%山羊血清在室溫下封閉30 min，然后用一抗P53(羅氏診斷，克隆號(hào)：DO-7)在4 ℃孵育過(guò)夜。在TBS中洗滌3次，每次5 min后，切片在室溫下用hrp標(biāo)記的二抗Ultra View Universal HRP Multimer(羅氏診斷)孵育2 h。然后在TBS中進(jìn)行3次，每次5 min的清洗。利用二氨基聯(lián)苯胺-過(guò)氧化物酶-底物系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)換。最后，使用蘇木精染色，顯色后在顯微鏡下觀察。以磷酸鹽緩沖液(無(wú)毒且與機(jī)體內(nèi)環(huán)境濃度接近,用于調(diào)節(jié)pH、清除實(shí)驗(yàn)干擾因素)代替一抗作陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)觀察8個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野取500個(gè)連續(xù)的腫瘤細(xì)胞,細(xì)胞存在染色即為陽(yáng)性細(xì)胞,確定陽(yáng)性細(xì)胞比例，陽(yáng)性細(xì)胞比例在60%以上定義為P53基因突變陽(yáng)性。所有標(biāo)本由兩位病理醫(yī)生獨(dú)立完成閱片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同分期結(jié)直腸癌中的SEPT9的陽(yáng)性檢出率

182例結(jié)直腸癌中，SEPT9陽(yáng)性檢出率為65.9%，隨分期發(fā)展，陽(yáng)性檢出率依次升高(表1)。

表1 不同分期結(jié)直腸癌中SEPT9陽(yáng)性檢出率

2.2 不同組織學(xué)類型下的SEPT9陽(yáng)性檢出率

術(shù)后病理結(jié)果顯示，腺癌占結(jié)直腸腫瘤組織學(xué)類型的大多數(shù)，達(dá)85.6%(179/209)，鱗癌僅有1.4%(3/209),并對(duì)腺癌進(jìn)行進(jìn)一步分型[9-11]。鱗癌、腺瘤和其他腸道腫瘤與腺癌比較，SEPT9的陽(yáng)性檢出率差異有顯著性(P<0.001；表2)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示在152例結(jié)直腸癌中，SEPT9陽(yáng)性樣本中P53基因突變的陽(yáng)性率為81.1%；SEPT9陰性樣本中，P53基因突變的陽(yáng)性率為70.2%，二者差異無(wú)顯著性(P=0.123；圖1和表3)。

表2 不同組織學(xué)類型中SEPT9基因甲基化陽(yáng)性檢出率比較 單位：例(%)

圖1 P53基因免疫組織化學(xué)結(jié)果(400×)上圖為陰性，下圖為陽(yáng)性。

表3 P53基因突變與SEPT9基因甲基化的關(guān)系 單位：例(%)

2.3 不同大體形態(tài)分型中SEPT9甲陽(yáng)性檢出率

術(shù)后病理顯示潰瘍隆起型為82.2%；隆起型為12.1%；潰瘍型為5.7%。SEPT9的陽(yáng)性檢出率分別為67.0%、35.3%的50.0%(表4)。

表4 不同大體形態(tài)分型中SEPT9基因甲基化檢出率及差異分析 單位：例(%)

3 討 論

CRC的致病機(jī)制是由多基因突變和表觀遺傳變異等逐漸積累和相互作用[13]，因此，研究CRC的多種發(fā)病機(jī)制之間的相關(guān)性具有重要的臨床意義，以便探索簡(jiǎn)單、安全、特異性更高、更敏感的分子標(biāo)志物可用于疾病的篩查、診斷和預(yù)后評(píng)估[14]。

目前SEPT9基因甲基化檢測(cè)結(jié)直腸癌的大部分研究集中在早篩或預(yù)后，而對(duì)大腸癌不同病理類型或形態(tài)學(xué)類型上的是否有檢出差異沒(méi)有涉及。本研究發(fā)現(xiàn)，SEPT9甲基化在腺癌(非特殊型)與腺癌(特殊型)，檢出率差異無(wú)顯著性，此前并無(wú)相關(guān)的文章和研究報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。而鱗癌、腺瘤、其他結(jié)腸癌腫瘤中陽(yáng)性檢出率顯著低于腺癌(包括特殊型與非特殊型)，其中腺瘤的檢出率低于報(bào)道的11.2%[14]，這種結(jié)果的差異可能是由于樣本量大小不同導(dǎo)致的。與文獻(xiàn)報(bào)道4.3%一致[15]。研究表明,在結(jié)直腸腺瘤和腫瘤標(biāo)本中觀察到的SEPT9基因異常甲基化從CGI3核向島的5′端擴(kuò)散[16]。從腺瘤到結(jié)直腸癌的發(fā)展過(guò)程中伴隨著這種甲基化擴(kuò)展。在腺瘤中，SEPT9基因異常甲基化僅擴(kuò)展到CGI3的5′端一部分，這可能是腺瘤中SEPT9基因甲基化檢出率較低的分子機(jī)制。

鱗癌在結(jié)直腸癌中發(fā)病率不高，也尚無(wú)SEPT9在結(jié)直腸癌鱗癌中的檢出率研究。本次研究也僅收集到3例，初步來(lái)看鱗癌中SEPT9基因甲基化的檢出率顯著低于腺癌。提示鱗癌在發(fā)病機(jī)制上不同于其他腺癌或印戒細(xì)胞癌，雖然鱗癌在結(jié)直腸癌中發(fā)病率不高，但是也是重要的類型，或許可以開(kāi)發(fā)更加優(yōu)異的針對(duì)結(jié)直腸癌鱗癌的腫瘤標(biāo)志物，用于輔助SEPT9對(duì)結(jié)直腸癌的檢測(cè)，更好的提高SEPT9的檢出率。

對(duì)同一樣本的P53基因突變和SEPT9基因甲基化的關(guān)系進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示P53基因突變與SEPT9基因甲基化是獨(dú)立的。這進(jìn)一步印證了不同病理類型的結(jié)直腸癌SEPT9檢出率的差異是真實(shí)的。

在形態(tài)分類中，隆起型、潰瘍型、潰瘍隆起型結(jié)直腸癌的SEPT9陽(yáng)性檢出率依次增高，隆起型結(jié)直腸癌中的SEPT9陽(yáng)性檢出率顯著低于其他形態(tài)學(xué)類型。這可能是由于從隆起型到潰瘍型再到隆起潰瘍型，腫瘤的大小逐漸增大，釋放到血液中的SEPT9基因甲基化片段依次增多，導(dǎo)致了SEPT9的陽(yáng)性檢出率依次升高。這與SEPT9用于預(yù)后監(jiān)測(cè)結(jié)果類似，當(dāng)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行放化療后，腫瘤變小或消除，SEPT9隨之變?yōu)殛幮浴＞C上所述，血漿游離DNA中甲基化SEPT9在CRC不同組織病理學(xué)類型、不同組形態(tài)學(xué)病理類型中以及干預(yù)治療后的檢出水平的差異和變化，對(duì)預(yù)后監(jiān)測(cè)或分子分型具有一定的臨床指導(dǎo)意義。