miR-17-5p在非小細胞肺癌患者中的表達及其與臨床病理特征的相關性

劉 建， 崔翰文， 張雪梅， 劉琳琳

(1.濟寧醫學院附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，山東省濟寧市272029；2.黑龍江省醫院呼吸內科，黑龍江省哈爾濱市150036)

肺癌是癌癥死亡的主要原因，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌92%，且近年發病率明顯增長[1]。盡管腫瘤藥物和癌癥治療方法不斷進步，但NSCLC患者5年生存率僅有15%，治療效果并不理想[2]。診斷時間較晚以及治療時間有限是導致其死亡的主要原因，尋找出一種NSCLC早期生物標志物具有重要的意義[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類在人類基因組中長度小于24 nt的非編碼單鏈RNA，可以在轉錄后通過改變其目標mRNA的表達和翻譯來調節生物過程，在腫瘤生物學領域已經作為一類新型的潛在生物標志物和藥物靶點出現，miRNA可以控制與肺癌發生有關的關鍵途徑，包括細胞增殖和轉移[4]。近年研究發現miR-17-5p廣泛參與多種癌癥的發生發展進程如喉癌、乳腺癌、肝癌等，但NSCLC方向相關報道較少[5-6]。因此，本研究臨床結合數據庫，探討NSCLC患者miR-17-5p表達差異，及其對腫瘤預后的影響，為miR-17-5p作為一種NSCLC的新型腫瘤生物標志物提供依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取本院2015年1月—2019年12月經病理確診NSCLC患者60例(NSCLC組),其中男36例，女24例；年齡42～75歲，平均(61.30±14.60)歲；體質量53～76 kg，平均(65.84±12.90)kg；臨床分期(國際肺癌TNM分期[7])Ⅰ期24人，Ⅱ期22人，Ⅲ期14人；淋巴結轉移42例，無淋巴結轉移18例。選擇同期體檢的正常健康人群60例作為健康對照組。所有受試者入選前均未接受任何化療、放療或靶向治療。搜集患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期和淋巴結轉移等資料。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者及家屬對本研究內容知情，并簽署知情同意書。

1.2 腫瘤組織miR-17-5p表達的相關數據庫分析

利用STARBASE數據庫的PAN-CANCER功能分析腫瘤組織和正常組織間的miR-17-5p表達差異，數據來源于TCGA(The Cancer Genome Atlas)RNA測序數據庫(http://starbase.sysu.edu.cn)，設定條件為：Entrance of The Platform：miRNA differential expression;miRNA:miR-17-5p;Cancer:Non-small cell lung cancer;Chart type:box plot;Data scale:log2-scale。分析結果通過箱狀圖表示。在Kaplan-Meier Plotters數據庫中分析高表達及低表達miR-17-5p在NSCLC患者中的生存差異。數據來自于TCGA數據庫和GEO(GeneExpression Omnibus)數據庫。

1.3 qRT-PCR檢測血清miR-17-5p表達

收集外周全血5 mL，離心獲取血清，采用qRT-PCR分析兩組miR-17-5p表達情況。參照Gene Bank數據庫miR-17-5p的序列，由上海生工生物工程有限公司提供miR-17-5p的特異度引物，以U6作為內參對照，所得結果標準化后輸入數據軟件進行分析。

1.4 ELISA檢測血清CEA、CYFRA21-1和CA125

收集外周全血5 mL，離心獲取血清，2 h內采用羅氏COBASE601發光化學免疫分析儀通過ELISA試劑盒(美國雅培公司)化學免疫分析法檢測CEA、CYFRA21-1和CA125的表達，分析其與患者臨床特征的相關性。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 miR-17-5p在腫瘤組織和正常組織中表達的比較

STARTBASE數據庫共分析了408例NSCLC組織樣本和19例健康人群的正常組織樣本，腫瘤組織中miR-17-5p的表達水平顯著高于正常組織(P<0.05，圖1A)。在數據庫中分析miR-17-5p差異表達對患者生存預后的影響，生存分析結果顯示高表達組258人，低表達組259人，低表達組預后明顯優于高表達組(HR=1.50，P<0.05，圖1B)。

圖1 miR-17-5p大數據分析A為miR-17-5p在NSCLC組織和正常肺組織的表達水平對比；B為NSCLC患者miR-17-5p高表達組和低表達組生存曲線。

2.2 血清miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA125的表達差異

與健康對照組比較，NSCLC組血清miR-17-5p表達水平顯著上調(P<0.05)；NSCLC組CEA、CYFRA21-1和CA125的表達水平均不同程度上調(P<0.05；圖2)。

圖2 各組血清miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA125表達的比較a為P<0.05，與健康對照組比較。

2.3 miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA12的表達與臨床病理特征的相關性

miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA12在NSCLC患者血清中高表達并與淋巴結轉移顯著相關(P<0.05，表1)。但未發現miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA12與其他臨床特征之間存在關聯(P>0.05，表1)。

表1 miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA125表達與NSCLC患者臨床特征之間的相關性

2.4 miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA125的預測價值

對血清miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA125的表達量進行ROC曲線分析并計算曲線下面積(AUC)。miR-17-5p診斷準確性AUC 0.738、95%CI 0.677～0.806、靈敏度70.0%、特異度82.2%(圖3A)。CEA、CYFRA21-1和CA125的診斷準確性分別為AUC 0.617、95%CI 0.571～0.712、靈敏度67.0%、特異度57.8%(圖3B)，AUC 0.684、95%CI 0.538～0.681、靈敏度49.0%、特異度73.3%(圖3C)，AUC 0.634、95%CI 0.530～0.674、靈敏度33.0%、特異度92.2%(圖3D)。miR-17-5p的曲線下面積要大于CEA、CYFRA21-1和CA125，且靈敏度要高于CEA、CYFRA21-1和CA125，說明miR-17-5p預測價值更優。

圖3 血清miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA125的ROC分析

3 討 論

miRNA通過影響mRNA的穩定性和翻譯，參與多細胞生物中基因表達的轉錄后調節[8]。miR-17-5p位于13號染色體上，是一個高度保守的miRNA，它在腸癌、胰腺癌、肝細胞癌中均表現出高表達的現象。miR-17-5p參與BTG3通路，在體內和體外導致直腸癌耐藥，拮抗miR-17-5p的表達可以抑制腫瘤耐藥性和腫瘤細胞增殖[9]。乳腺癌相關研究發現，血漿外泌體中miR-17-5p可作為乳腺癌的潛在生物學標志物[10]。但在胃癌的研究中發現，胃癌患者血清的miR-17-5p表達下調且與腫瘤大小、淋巴結轉移和TNM分期相關[11]。故miR-17-5p可作為一種參與腫瘤發生發展的檢測因子進行研究。

目前早期NSCLC的主要治療模式是進行手術，但30%～55%的患者依然出現了復發并導致死亡[12]。NSCLC是一種分子機制復雜的腫瘤疾病，高特異度的預測性生物標志物可為患者的有效治療提供優質保障。目前迫切需要一種新型的預測標志物應用于臨床，以提高患者的長期生存率。血清miRNA在特異組織中穩定表達，同時較患者的腫瘤組織和血液樣本更易在臨床中獲取，越來越多的研究為，血清miRNA可以作為一種與腫瘤的發生發展和預后密切相關的非侵入性檢測標志物[4]。在NSCLC組織中miR-451表達減少，其表達與淋巴結轉移、TNM分期和預后不良呈負相關[13]。而miR-10a在NSCLC組織中被上調，激活了PTEN/Akt/ERK通路，促進腫瘤細胞的增殖和轉移[14]。本研究中，大數據分析顯示與健康人群的正常組織比較，miR-17-5p在NSCLC患者癌組織中高表達，并且與NSCLC患者的預后影響高度相關，miR-17-5p高表達的患者生存率表現較低，顯示為NSCLC預后危險因素。在隨后的驗證中也發現，miR-17-5p與CEA、CYFRA21-1和CA125這些臨床常用的腫瘤標志物一樣，均在腫瘤患者體內高表達，并且通過比較miR-17-5p與CEA、CYFRA21-1和CA125的診斷效力，結果顯示，miR-17-5p表現出良好的預測價值。這些結果支持血清中miR-17-5p作為一個潛在的應用于NSCLC的檢測標志物。

為進一步分析血清中miR-17-5p的臨床意義，本研究發現miR-17-5p與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期之間不存在顯著關聯，但與淋巴結轉移存在顯著關聯。這意味著miR-17-5p與腫瘤轉移密切相關。此外，也有一項通過基因芯片對宮頸癌組織樣本的研究發現，miR-17-5p在腫瘤組織中高表達，并且miR-17-5p靶向TGFBR2提高宮頸癌細胞增殖和轉移[15]。肺部淋巴結豐富，淋巴結轉移是NSCLC的主要轉移途徑，且淋巴結轉移發生的患者5年生存率僅為4%，顯著低于未發生淋巴結轉移的患者[16]。

綜上可知，血清miR-17-5p可作為NSCLC的臨床腫瘤標志物。miR-17-5p在NSCLC患者血清中的表達顯著高于健康人群，且與患者的預后關系密切。