依達拉奉對煙霧吸入性損傷大鼠肺的保護作用

肖長栓,劉婭平,楊景哲

(承德醫學院附屬醫院 1.燒傷整形科，2.婦二科，河北省承德市 067000)

吸入性損傷發病隱匿、癥狀多不典型，是一種呼吸道和肺實質共同損傷的燒傷危急重癥。吸入性損傷后，肺部可發生嚴重失控性炎癥反應，產生大量氧自由基，多表現為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)及多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODF)[1]。因此，為其尋找早期適當干預手段一直是國內外研究的熱點問題。依達拉奉(edaravone，EDA)通過抑制脂質過氧化及抗氧化從而發揮神經系統保護作用、減輕多種原因所致的肺組織損傷[2-5]。EDA容易穿過細胞膜且霧化吸入可直接作用于靶器官[6]。本實驗通過霧化吸入EDA干預煙霧吸入性肺損傷大鼠模型，研究其對該模型大鼠肺的保護作用。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

依達拉奉(edaravone，EDA)購自雙鶴藥業有限責任公司(原料藥，國藥準字H20130053，純度：99.7%)。大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine protease 3，Caspase-3)酶聯免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國R&D公司；大鼠肺髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、考馬斯亮藍蛋白檢測試劑盒購自南京建成公司；原位末端標記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測陽性對照制備試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；微量加樣器購自德國Eppendorf公司；ELX800UV型酶標檢測儀購自美國Bio Tek公司；CK40型光學顯微鏡購自日本Olympus公司；Centrifuge5702離心機購自德國Eppendorf公司；RM2235型石蠟切片機購自德國Leica公司；ABL-800型血氣分析儀購自丹麥Radiometer公司；PARI Turbo BOY N系列霧化機購自德國PARI GmbH公司；KD-BM生物組織包埋機購自浙江科迪儀器設備公司。

1.2 實驗動物及分組

清潔級雄性SD大鼠30只，60～70日齡，體質量約(200±20)g，由中國食品藥品檢定研究院提供，動物生產許可證號：SCXK(京)2017-0005。飼養溫度22～25 ℃，自由飲食、飲水。并于實驗前12 h禁食、自由飲水。將其隨機分為對照組、模型組、EDA低劑量組、EDA高劑量組、EDA預防組，每組6只。本實驗獲承德醫學院附屬醫院醫學倫理委員會批準，動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.3 動物造模及干預方法

參考文獻[7]，各組腹腔注射鹽酸氯胺酮(0.1 mg/g)后行氣管切開術：頸胸部剃毛消毒后鋪無菌巾，行頸胸部正中切口，氣管切開，置入氣管導管。氣管導管連接呼吸機螺紋管后以4601型小動物呼吸機行機械通氣，呼吸頻率為80次/min，潮氣量為10 μL/g，吸呼比為1∶2，吸入30%的氧。螺紋管末端連接三通管后與壓力轉換接頭相連，動態監測氣道壓(airway pressure,Paw)。Paw穩定20 min后，參照文獻[5,8]，除對照組外其他組大鼠制作煙霧吸入性損傷模型：煙霧發生器打開致傷室進氣口閥門和風扇，內置入適量松木屑后發煙15 min，當煙霧報警器報警后打開排氣口閥門、風扇，排氣口用聚乙烯導管連接三通管一端，使各組大鼠均勻吸入煙霧5 min后關閉排氣口閥門5 min，按上述步驟操作3次。

參照文獻[9]設定各組大鼠藥物干預時間和劑量：對照組不吸入任何藥物；模型組、EDA低劑量及高劑量組分別在致傷后30 min霧化吸入生理鹽水、1.8 g/L、3.6 g/L EDA，0.1 mL/min，10 min，間隔1 h重復1次，共4次；EDA預防組致傷前10 min(預處理)霧化吸入1.8 g/L EDA 0.1 mL/min，10 min，致傷后30 min霧化吸入1.8 mg/mL EDA 10 min，間隔1 h重復1次，共3次。

1.4 氧合指數、肺組織含水率及濕干比測定

致傷后6 h，留取各組大鼠頸動脈血1 mL 30 min內行血氣分析，計算氧合指數(oxygenation index，OI)；剖腹留取腹主動脈血5 mL后處死動物，迅速取出肺組織，選擇右肺組織前葉及中葉標本，稱濕重并記錄，隨后放入恒溫電烤箱中80 ℃烘烤48 h，稱干重并記錄。含水率(%)=(濕重-干重)/濕重×100%，濕重與干重之間比值為濕干比(wet to dry ratio，W/D)。

1.5 血清TNF-α、IL-6、IL-10測定

采用雙抗體夾心ELISA法。將腹主動脈血標本離心15 min后取上清液，-20 ℃冷凍保存。解凍血清標本，嚴格按照試劑盒說明書操作，酶標儀450 nm波長處讀取光密度(optical density，OD)值，計算樣品中TNF-α、IL-6、IL-10含量。

1.6 肺組織MDA、MPO、SOD測定

將取出的左肺組織保存于-70 ℃冰箱中。解凍左肺組織標本，濾紙吸干，電動研磨器充分研磨，制備組織勻漿?？捡R斯亮藍蛋白測定法測定勻漿液中蛋白水平后嚴格按照試劑盒說明書，分別在460、532、550 nm波長處測定各管MDA、MPO、SOD的OD值，計算組織中MDA、MPO、SOD含量。

1.7 肺組織Caspase-3、細胞凋亡率測定

取肺組織勻漿液適量，按照試劑盒說明書操作，酶標儀在450 nm波長處讀取各管OD值，計算組織中Caspase-3含量。采用TUNEL方法分析肺組織細胞凋亡情況。將取出的右肺后葉經4%的甲醛固定24 h，取適量固定好的右肺后葉組織脫水、包埋、切片、TUNEL染色。每只大鼠隨機選取5個非重疊高倍鏡視野(400×)，計數凋亡細胞數和細胞總數，細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.8 肺組織蘇木精-伊紅染色切片

取適量4%甲醛固定好的右肺后葉，依次進行脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色后光鏡下觀察。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 各組OI、肺組織含水率及W/D的比較

與對照組比較，其余各組OI均明顯降低，肺組織含水率、W/D均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，EDA低劑量、高劑量及預防組OI明顯升高(P<0.05)，呈遞增趨勢；肺含水率、W/D顯著降低，呈遞減趨勢(P<0.05；表1)。

表1 各組OI、肺組織含水率及W/D的比較(n=6)

2.2 各組血清TNF-α、IL-6及IL-10水平的比較

與對照組比較，其余各組TNF-α、IL-6及IL-10水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，EDA低劑量、高劑量及預防組TNF-α、IL-6水平均顯著降低，呈遞減趨勢；IL-10水平均明顯升高，呈遞增趨勢(P<0.05；表2)。

表2 各組血清TNF-α、IL-6、IL-10水平的比較(n=6) 單位：ng/L

2.3 各組肺組織MDA、MPO及SOD水平的比較

與對照組比較，其余各組MDA、MPO水平均明顯升高，SOD水平均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，EDA低劑量、高劑量及預防組MDA、MPO水平顯著降低，呈遞減趨勢；SOD水平明顯升高，呈遞增趨勢(P<0.05；表3)。

表3 各組肺組織MDA、MPO、SOD水平的比較(n=6)

2.4 各組肺組織Caspase-3含量及細胞凋亡率比較

與對照組比較，其余各組Caspase-3含量及細胞凋亡率均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，EDA低劑量、高劑量及預防組Caspase-3含量及細胞凋亡率均顯著降低，呈遞減趨勢(P<0.05；表4)。

表4 各組肺組織Caspase-3含量及細胞凋亡率的比較(n=6)

2.5 肺組織病理切片檢查

對照組肺泡腔內無炎性細胞浸潤，且結構清晰、完整，壁光滑且均勻；模型組肺泡腔內有大量炎癥細胞浸潤及紅細胞漏出，肺泡結構混亂，呈不同程度的擴張或萎縮，肺泡壁增厚明顯且厚度不勻；EDA低劑量組肺泡腔內仍有一定數量的炎癥細胞浸潤及紅細胞漏出，肺泡結構不清晰，仍有一定程度的擴張或萎縮；EDA高劑量組炎癥細胞浸潤及紅細胞漏出程度較EDA低劑量組減輕，肺泡結構較清楚，大小及形態較一致；EDA預防組肺泡腔內炎癥細胞浸潤及紅細胞漏出程度最輕，肺泡結構、大小及形態較EDA高劑量組進一步改善(圖1)。

圖1 各組大鼠肺組織病理切片(HE，400×)

3 討 論

吸入性損傷后，機體釋放大量炎癥介質、細胞因子及氧自由基，啟動凋亡信號通路，造成肺及其他多臟器的繼發性損害[5,10]。肺損傷后形成肺水腫的原因可能是局部微循環障礙，微血管阻力升高，肺順應性及氧合能力降低[11]。本實驗通過檢測氧合指數、肺組織含水率及W/D反映肺水腫及微血管損傷的程度。依達拉奉可通過降低炎癥細胞因子水平及抑制細胞凋亡通路改善腦損傷所致的神經功能癥狀[12-13]。結果顯示各組致傷大鼠肺泡腔內外可見炎癥細胞浸潤，提示煙霧吸入性肺損傷模型制作成功；模型組較對照組肺組織含水率及W/D顯著升高、OI降低，EDA各組又較模型組肺含水率及W/D降低、OI升高，炎癥細胞浸潤減輕，且上述變化EDA預防組最明顯，說明霧化吸入依達拉奉能減輕炎癥細胞浸潤及肺組織氧合情況，并具有劑量依賴性，且早期應用效果較好，但具體作用原理需深入研究。

近年來，對于合并吸入性損傷的患者仍缺乏有效的干預方法[11]。以往研究表明，對于肺損傷預防性應用依達拉奉，研究對象未出現任何藥物不良反應，研究結論具有一定臨床指導意義并得到普遍認可[14]；吸入性損傷漏診率較高，早期干預還可把握最佳的治療時機，降低后期的治療難度及死亡率。

吸入性損傷可促進多種炎癥細胞產生及釋放TNF-α，可增加骨髓白細胞釋放、激活外周血管內皮細胞及促進血液中多形核白細胞趨化吞噬能力，提高IL-1、IL-6等細胞因子的水平[15]。高水平的IL-6可啟動并延續局部及全身級聯瀑布式炎癥反應。TNF-α、IL-6是反映組織損傷程度的重要標志，可提示多臟器功能障礙，因此可作為觀察肺損傷治療效果的可靠指標[16]。IL-10可通過下調主要組織相容性復合物、抑制單核巨噬細胞合成分泌TNF-α、IL-6及IL-1β，對組織細胞起到顯著的保護作用[17-18]。本實驗通過測定IL-10的水平來間接反映機體抗炎能力。本文中EDA各組較模型組血清IL-6、TNF-α水平均降低，IL-10水平均升高，且此變化以EDA預防組最突出，說明對于煙霧吸入性損傷，霧化吸入依達拉奉具有良好的抗炎作用，并呈劑量依賴性，且預防用藥效果更好。

SOD可通過抑制化學趨向性因子，切斷炎癥反應通路發揮抗氧化作用，是反映清除氧自由基能力的重要指標[12]。炎癥細胞相互作用可使肺部MPO活性升高，反映了組織細胞中炎癥細胞的浸潤程度。MDA為脂質過氧化中產物，反映組織細胞受自由基的攻擊程度[19]。模型組MDA及MPO水平較對照組升高，SOD降低，機體氧化/抗氧化平衡被破壞，EDA各組較模型組呈反向變化，且此變化EDA預防組最明顯，表明高劑量霧化吸入依達拉奉對煙霧吸入性損傷具有更為顯著的抗氧化作用，且預防性用藥效果更好。

吸入性損傷發生后，細胞內線粒體膜通透性增加，細胞色素C等凋亡啟動因子逸出，使凋亡執行因子Caspase-3活性增加，導致廣泛的組織細胞凋亡，誘導并加重肺損傷[20]。Caspase-3的活化是細胞凋亡進入不可逆階段的重要標志，本實驗通過測定肺組織中Caspase-3含量及細胞凋亡率，來反映吸入性損傷過程中肺組織的凋亡情況。模型組肺組織Caspase-3及細胞凋亡率水平均較對照組升高，而EDA各組上述指標水平較模型組則明顯降低，且EDA預防組降低程度最明顯，說明霧化吸入依達拉奉可能通過Caspase-3信號通路使吸入性損傷后肺組織細胞凋亡程度減輕，并表現為劑量依賴性，預防用藥的效果更好。

綜上，霧化吸入依達拉奉可能通過減少炎癥介質/細胞因子的產生及釋放、降低過氧化損傷及抑制細胞凋亡對煙霧吸入性肺損傷起到保護作用，在一定范圍內呈明顯的劑量依賴性，且適當時機的預防性用藥效果更佳。