巨魾(Bagarius yarrelli)全基因組微衛星分布特征分析

楊汶珊,唐榮葉,蘇孟園,徐杰杰,王 濤,尹紹武

(1.南京師范大學海洋科學與工程學院,江蘇 南京 210023) (2.江蘇省特色水產育種與綠色高效養殖技術工程研究中心,江蘇 南京 210023)

巨魾(Bagariusyarrelli)屬于脊椎動物亞門(Vertebrate),硬骨魚綱(Teleostei),鲇形目(Siluriformes),鮡科(Sisoridae),魾屬(Bagarius). 巨魾的皮膚為棕栗色,身體呈流線形,頭部寬大、略扁. 因肌肉呈黃色,俗稱“面瓜魚”“黃魚”,個體可超過50 kg[1]. 巨魾在自然環境下,以攝食魚蝦和水生昆蟲等為主,偶食植物碎屑;在人工馴養條件下,僅攝食動物餌料[2]. 此外,巨魾肉質風味獨特,深受云南各地人民的喜愛. 目前,云南省水產研究所等單位已成功地對巨魾進行了人工繁殖[3].

微衛星又稱簡單序列重復(simple sequence repeats,SSRs),是指以1～6 bp核苷酸為基本重復單位組成的重復序列,在自然界的各種生物基因組中均有分布[4]. 微衛星因具有易于檢測、多態信息含量高、高效穩定、分布廣泛等優點,已被廣泛應用于魚類種群遺傳多樣性分析[5-6]、遺傳育種[7]、親子鑒定[8]等研究中.

目前巨魾全基因組已完成測序,Scaffold N50=3 129 371 bp,Contig N50=1 854 961 bp,并于2019年在線公布,但還未見巨魾基因組水平上微衛星相關的研究報道. 本研究通過對巨魾全基因組中的微衛星進行篩選,統計其所含不同類型的微衛星的數量、豐度、密度等數據,分析其分布特征及組成情況,為今后開發巨魾高質量的微衛星標記奠定一定的基礎.

1 材料和方法

1.1 材料

巨魾全基因組從NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Bagarius+yarrelli)下載,該基因組序列總大小約為570 Mb,下載的巨魾全基因組所有序列均以FASTA文件格式保存.

1.2 方法

利用微衛星篩選軟件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對巨魾全基因組進行掃描,篩選符合條件的完整型微衛星序列,在篩選后的結果中統計出1～6個堿基重復的完整型微衛星,使用EXCEL統計分析出各堿基類型的數量和分布情況,分別列出其分布特征和占比情況. 搜索標準參考MISA默認參數設置,即要求單堿基重復≥10次,二堿基重復≥6次,三、四、五、六堿基重復≥5次. 經過前期的大量研究可知,以此標準搜索全基因組微衛星得出的結果最優[9]. 根據起始堿基順序的差異及堿基互補配對原則,對屬于同一類別的微衛星進行同類合并,如三堿基AAT,可以與之兼并的有ATA、TAA、TTA、TAT和ATT.

2 結果與分析

2.1 巨魾全基因組各重復類型微衛星分布特征

如表1所示,巨魾全基因組完整型微衛星總數為360 235個,6種完整型微衛星的總長度為6 998 449 bp,占基因組的1.23%,豐度為631個/Mb,密度為12 261 bp/Mb. 6種微衛星豐度與微衛星數量變化的情況相同,即微衛星數量越多則豐度越大. 每種微衛星的密度與微衛星的長度有關,即某一類型微衛星的長度越長,其密度越高.

表1 巨魾全基因組中不同類型微衛星統計Table 1 Different types of microsatellite statisticsin the B.yarrelli genome

如圖1所示,數量最多的是單堿基類型,其次是二堿基類型,其余微衛星占比均小于10%,依次為三堿基、四堿基、五堿基類型,占比最少的是六堿基類型. 豐度隨著1～6 bp堿基的基本重復單位的增加而降低.

如圖2所示,在巨魾1～6個堿基重復的6種完整型微衛星中,長度最長的是二堿基類型,其余根據降序排列依次為單堿基、四堿基、三堿基、五堿基. 長度最短的為六堿基.

圖1 巨魾不同類型微衛星數量占比Fig.1 The proportion of microsatellites of different typesin B.yarrelli

圖2 巨魾不同類型微衛星總長度占比Fig.2 The proportion of different types of total length ofmicrosatellites in B.yarrelli

圖3 巨魾各類型微衛星不同拷貝數分布Fig.3 Distribution of different copy numbers ofvarious types of microsatellites in B.yarrelli

2.2 巨魾全基因組不同類型微衛星重復次數分布

巨魾基因組中各類型微衛星重復次數集中在5～30次之間,數量占全部微衛星的99.66%. 在6種重復類型微衛星中,微衛星數量最多的拷貝次數均為MISA軟件篩選出來的最小重復次數. 如圖3所示,單堿基重復的分布范圍最廣,最低重復次數為10次,最高重復次數為249次,其中微衛星主要重復次數為10～20次,其數量占單堿基SSR總數的95.26%;二堿基重復的分布范圍也較廣,最低重復次數為6次,最高重復次數為130次,其中微衛星主要重復次數為 6～30次,其數量占二堿基微衛星總數的96.16%;三堿基微衛星重復拷貝數分布在 5～35 次之間,其中微衛星主要重復次數為5～15次,數量占三堿基微衛星總數的99.18%;四堿基最低重復次數為5次,最高重復次數為63次,微衛星主要重復次數為5～20次,數量占四堿基微衛星總數的96.81%;五堿基重復拷貝數分布在5～40次,微衛星主要重復次數為5～15次,數量占比為96.53%;六堿基重復拷貝數分布范圍最小,最低重復次數為5次,最高重復次數僅為21次,微衛星主要重復次數集中在5～10次,數量占比為94.90%.

2.3 巨魾全基因組微衛星各重復堿基類別特征

如圖4所示,巨魾全基因組微衛星中的優勢拷貝類別按照數量從高到低排列分別為:A、AC、AG、AT、AAT、C、ATAG、AAAT、ACT和ATC,這10種拷貝類別總數為339 090個,占微衛星重復拷貝類別總數的94.13%.

圖4 巨魾全基因組中分布最多的不同重復拷貝類型微衛星Fig.4 Distribution of the most frequent microsatellite motifs of B.yarrelli

如表2所示,單堿基類別中,單堿基數量以A類別(A/T)為主,占有絕對的堿基優勢,其次是C類別. 二堿基類別中,AC類別是主要的重復單元,其次分別是AG類別和AT類別;CG類別數量最少,僅有138個,占比0.09%. 三堿基類型中,AAT類別數量最多,其次分別是ACT類別和ATC類別;CCG類別在三堿基10種類別中數量最少,只有93個,占比0.42%. 四堿基類型中,ATAG類別重復數量最多,其次分別是AAAT類別和AGAC類別. 五堿基類型中,AATCT類別重復數量最多,其次分別是AAGAG類別和AATAT類別. 六堿基類型中,AACCCT類別重復數量最多,其次是AGGGTT類別,其余類別重復數量較少.

表2 巨魾全基因組中各堿基重復類型中的優勢堿基類別Table 2 The dominant base classes in each base repeat type in the B.yarrelli genome

3 討論

3.1 巨魾微衛星在全基因組中的含量分析

本研究以巨魾全基因組為基礎,利用生物信息學軟件對巨魾基因組中6種完整型微衛星進行搜索,共搜索到360 235個完整型微衛星,其長度為6 998 449 bp,占基因組序列總長度的1.23%. 分析表明,巨魾全基因組微衛星含量(1.23%)與已公布的人(Homosapiens)(3%)[10]、嚙齒目的大鼠(Rattusnorvegicus)(1.41%)[11]和小鼠(Musmusculus)(2.85%)[12]相比較低,但高于偶蹄目的牛(Bostaurus)(0.48%)、牦牛(Bosmutus)(0.58%)、藏羚羊(Pantholopshodgsoni)(0.54%)[13-15],食肉目的大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)(0.64%)、北極熊(Ursusmaritimus)(0.79%)[16],鲀形目的紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)(0.73%)、菊黃東方鲀(Takifuguflavidus)(0.73%)、雙斑東方鲀(Takifugubimaculatus)(0.84%)、黑青斑河鲀(Tetraodonnigroviridis)(1.06%)[9]. 巨魾全基因組微衛星含量與同為鲇形目的黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)(1.8%)[17]有一定差異. 這些結果表明,不同物種的微衛星在全基因組中含量具有較大的差異,這種差異一方面可能是不同物種基因組大小的區別造成的,另一方面可能還有物種進化差異的原因.

3.2 巨魾全基因組各堿基類型微衛星特征分析

對比同屬于魚綱的物種,結果顯示巨魾基因組中的優勢堿基類型排序與骨舌魚目的美麗硬仆骨舌魚(Scleropagesformosus)[18]以及鲀形目的紅鰭東方鲀、菊黃東方鲀、雙斑東方鲀[9]的分布順序一致,也與鯉形目的鯉魚(Cyprinuscarpio)[19]的優勢堿基類型分布順序完全一致. 但與同為鲇形目的黃顙魚[17]的優勢堿基類型分布順序不同,也與鰈形目的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[20]的優勢堿基分布不同.

對比動物界各綱的物種,結果顯示魚綱(如巨魾、美麗硬仆骨舌魚、紅鰭東方鲀、鯉魚、黃顙魚和大菱鲆)[9,17-20]主要以單堿基和二堿基占優勢. 鳥綱(如白鷺(Egrellagarzetta)、藏雞(Gallusgazettedomesticus)、綠尾虹雉(Lophophoruslhuysii)、紅原雞(GallusLophophores)和虎皮鸚鵡(Melopsittacusundulatus))[21-25]和哺乳動物(如豬(Susscrofa)、林麝(Moschusberezovskii)、大熊貓、北極熊、耗牛和水牛(Bubalusbubalis))[14,16,26-27]的優勢堿基類型排序均以單堿基微衛星占優勢,而六堿基微衛星最少,但哺乳動物中的大鼠以二堿基微衛星占優勢,六堿基微衛星最少[11],說明大部分鳥綱動物和哺乳動物的微衛星分布順序以單堿基微衛星占優勢,六堿基微衛星占比最少,個別鳥綱和哺乳動物分布規律略有不同. 而對比低等無脊椎動物中的一些昆蟲綱動物,如草地貪夜蛾(Bubalusbubalis)、果蠅(Drosophilamelanogaster)、蚊子(Anophelesgamblae)[28-30],其優勢堿基類型排序各有不同,優勢堿基排序較為隨機. 在原核生物和酵母(Saccharomycescerevisiae)的基因組中,處于優勢的重復序列類型是三堿基[18].

從以上對比結果中可發現,巨魾與鳥綱、昆蟲綱以及硬骨魚綱中的鲀形目與鯉形目中的一些物種的優勢微衛星類型排序相同,但與同為鲇形目的黃顙魚的優勢堿基類型排序不同,這表明物種的親緣關系與其優勢堿基類型排序并無明顯聯系. Webster等[31]研究了黑猩猩與人類基因組的微衛星分布,研究結果表明,即使物種的親緣關系相近,其微衛星分布也存在很大差別. 本研究中對鳥綱、哺乳動物、昆蟲綱以及硬骨魚綱的一些物種的比較分析也支持了這一說法. 另外可發現,大多數物種為單堿基或二堿基占優勢,少部分真菌及低等動物則為三堿基或六堿基數目最多,如酵母[32]和二斑葉螨(Tetranychusurticae)[33]以三堿基占優勢,蚊子以六堿基占優勢[30]. 黃杰等[5]認為高等生物基因組更傾向于單堿基微衛星占優勢,魚綱和鳥綱以單堿基或二堿基占優勢,未見三堿基占優勢的報道. 在原核生物和酵母的基因組中,處于優勢的重復序列類型是三堿基,而比其更高等的生物基因組則傾向于二堿基和單堿基重復序列類型[18]. 這些結果一方面說明不同物種基因組的優勢類型微衛星不同,另一方面說明物種在向高等動物的進化過程中傾向于選擇二堿基和單堿基重復序列類型.

3.3 巨魾全基因組微衛星各堿基類型不同類別特征分析

在巨魾6種堿基類型微衛星中,A、AC、AAT、ATAG、AATCT和AACCCT類別分別為1～6堿基重復類型中數量最多的一類,可以看出明顯的A/T優勢.

在巨魾單堿基重復中,A類別(A/T)數目最多,在單堿基微衛星中占比93.94%,這與已公布的人、黃顙魚、紅鰭東方鲀、中華按蚊(Anophelessinensis)[9-10,17,34]等大部分已公布的物種全基因組微衛星特征一致.

在二堿基重復中,AC類別微衛星數量最多,其次是AG與AT類別,與人、黃顙魚、美麗硬仆骨舌魚和紅鰭東方鲀[9-10,17,21]等物種二堿基前三類別排序相一致. 與其他物種對比發現,大多數高等哺乳動物和硬骨魚綱的二堿基優勢重復類型均為AC類別,而鳥綱的二堿基優勢重復類型為AT類別,推測高等哺乳動物、鳥綱和硬骨魚綱的優勢重復類型的差別可能與物種進化有關. 有研究表明,AT類別重復為陸地生物的優勢重復類型,而海洋生物海鞘(Cionaintestinalis)中CG和AG類別的重復次數較多,可看出微衛星優勢堿基類型在陸地和海洋生物間并不相同[35]. 同時對比顯示,巨魾、美麗硬仆骨舌魚和黃顙魚均屬于淡水生物,其結果與海洋生物海鞘的分析有相同和不同之處,相同之處是AG類型均為排序第二的優勢堿基類別,差異之處在于海鞘的CG類別重復次數較多,而在這三種魚中CG類型均最少. 造成這種異同的原因可能是海洋生物和淡水生物生存環境的差別所致. 另外關于CG類別比AT類別少的原因,有研究認為,在DNA復制的過程中會產生滑移,從而形成了微衛星[36],推測可能是由于AT之間的雙鍵比CG之間的三鍵更容易斷裂,因此更容易造成堿基滑動,從而導致AT重復拷貝類別比CG重復拷貝類別在數量上更具優勢.

在三堿基重復中,AAT類別占絕對優勢,這與虎皮鸚鵡、紅原雞和黃顙魚[17,25-26]相同. 此外與其他高等動物、鳥綱和硬骨魚綱的三堿基優勢類別對比中并未發現明顯規律. 有研究表明,某些遺傳性病變與三堿基重復有關[37],某些微衛星會由于其不穩定性改變基因的表達從而導致某些遺傳性病變的發生[38]. 因此,通過研究巨魾的三堿基微衛星可以了解巨魾某些疾病的發生原因,同時還可以幫助確定和預測一些人類疾病相關的基因.

在四堿基重復中,ATAG和AAAT類別的數量排在前二. 通過對微衛星作用的研究表明,在遺傳標記上四堿基微衛星相比于二堿基和三堿基微衛星更為精確和可靠[39]. 因此在開展巨魾遺傳多樣性分析、物種鑒定以及親子鑒定等研究中,巨魾的四堿基多態性微衛星標記可能能提供參照. 研究結果顯示,巨魾四堿基微衛星共有17 279個,同時其統計到的重復類別有31個,大量的微衛星和較多的重復類別在開發巨魾四堿基微衛星標記中將提供較大幫助. 吳旭東等[40]研究表明,鲇形目魚類的微衛星側翼序列在同目內種間具有保守性,同目魚類的部分微衛星引物與其他的魚類也存在一定的通用性. 這說明微衛星序列可能隨著物種的進化而不斷變化,由于選擇壓力等原因,使得親緣關系相近的物種其微衛星側翼序列也接近. 本研究可為同為鲇形目的其他魚類的微衛星開發提供參照.

AATCT、AAGAG和AATAT類別為五堿基中的前三類別,六堿基中的AACCCT和AGGGTT類別占主導地位. 基因組中重復最多的前10種微衛星拷貝類型表明,微衛星中存在明顯的A/T優勢,而C/G數量較少. 魏朝明等[41]研究認為,由于不同堿基排列編碼的基因其蛋白質擁有不同的功能,所以位于編碼基因上的微衛星也行使著不同的功能. 因此A/T的堿基組合可能擁有某些功能,與物種的某些生物特性有關. 同時還有研究表明,物種基因組中微衛星標記數越多,A和T堿基所占比例越高[42]. 對于這一現象,Schl?tterer等[36]認為,基因組DNA由于甲基化的發生,胞嘧啶C容易脫氨基從而轉變成胸腺嘧啶T. 基因組內CG含量少也是維持DNA熱力學穩定性的必要條件之一[43]. 另外,CG堿基重復的測序工作較為困難也可能是數據中CG含量少的原因[44].

3.4 巨魾全基因組微衛星各堿基類型拷貝數特征分析

研究表明,在巨魾基因組中,除了細微的波動外,6種堿基類型均隨著重復拷貝數的增加其微衛星數量逐漸遞減. 同時數據顯示,即使不同篩選軟件的參數設置不同,最低參數的微衛星數量也遠超過倒數第二參數設定的微衛星重復拷貝數量. 這種現象同樣出現在黃顙魚、藏羚羊、虎皮鸚鵡和紅原雞等物種全基因組微衛星中. 對此,Wierdl等[45]認為,一方面與微衛星穩定性有關,即隨微衛星長度的增加,其穩定性會下降,因此當重復拷貝數越高時越容易發生堿基突變而成為不完整型微衛星或非微衛星序列,這使得重復數越多的微衛星數量越少;另一方面,Harr等[46]認為,微衛星重復拷貝數越高,突變率就越高,使得越長的微衛星序列數目越少. 同時還有研究表明,長等位基因傾向于變得更短,從而抑制了微衛星長度變長的趨勢,因此,微衛星長度越長,即重復拷貝數越多,該種微衛星越不易存在[47].

4 結論

綜上所述,在對巨魾全基因組微衛星進行統計與分析,并對比其他物種的微衛星分布特征后得出如下結論:

不同物種的微衛星在全基因中含量具有較大差異,且不同物種的優勢堿基類型與物種的親緣關系無關;

原核動物以三堿基占優勢,高等動物以單堿基和二堿基占優勢;

各物種的重復類別微衛星都表現出明顯的A/T堿基類別的優勢;

6種堿基類型基本隨著重復拷貝數的增加其微衛星數量逐漸遞減.

目前本研究已統計了微衛星在巨魾全基因組中的數量、豐度和密度等數據,并分析了其特征和組成情況,為巨魾種群遺傳多樣性分析、圖譜構建和品系親緣關系鑒定等提供了數據支持,期望能對巨魾微衛星標記開發提供幫助.