臨床HCV血清及其純化核酸在不同儲存條件下的穩定性分析*

王嫣 王海濱 徐東平 許友山 夏衛

丙型病毒性肝炎不僅是威脅人類健康的傳染病，而且也影響臨床的輸血安全。全球約有1.8億人口感染丙型肝炎病毒（HCV），且全世界范圍內每年新感染HCV的患者高達10萬人[1-2]。HCV主要通過血液傳播，國外30%～90%輸血后肝炎為丙型肝炎，我國輸血后肝炎中有33%為丙型肝炎[1]。 HCV核酸檢測不僅能顯著縮短HCV篩查的窗口期，而且是臨床評價病毒復制水平及監測治療效果的重要參考依據[3]。然而，HCV是一種高度變異的正鏈RNA黃病毒，離體后易受外界環境的影響引起RNA降解。在臨床或科研實踐中，樣本采集后經運輸和保存，甚至某些樣本被反復凍融后才檢測分析，這些過程均可導致病毒RNA發生降解，造成“窗口期”感染的漏檢，不僅威脅血液質量安全，而且影響臨床醫生對患者體內HCV水平的準確評估。因此研究不同濃度HCV血清及其純化核酸在不同儲存條件下的穩定性特點具有重大意義。

本文用血站HCV陰性獻血者血清作為稀釋液將臨床收集的107IU/mL HCV血清稀釋成105IU/mL、103IU/mL，探討臨床常見的高、中、低三種濃度HCV血清及其純化核酸隨時間、溫度（25 ℃、4℃、-20 ℃）的變化特點。

材料與方法

1 一般資料 樣本來源于2018年7月～2019年6月在解放軍總醫院第五醫學中心（原解放軍三O二醫院）確診為丙型病毒性肝炎患者58例，該院臨檢中心檢測血清抗HCV抗體均為陽性且HCV RNA載量為107IU/mL，診斷符合2004年公布的《病毒性肝炎防治方案》的診斷標準[4]。由該院的全軍傳染病研究所臨床研究管理中心收集血清于50 mL離心管-20 ℃凍存，忽略期間的降解，以實驗稀釋后的濃度為實驗的初始濃度。2019年5月～6月本站收集100例經2次血清抗體檢查和1次核酸篩查后正常的獻血者血清作為本實驗的稀釋液，干冰保存運輸至全軍傳染病研究所臨床研究管理中心，并由該實驗室開展3種不同濃度HCV血清及其純化核酸隨時間、溫度（25 ℃、4 ℃、-20℃）變化特點的研究。

2 儀器與試劑 儀器采用上海宏石SLAN 96P熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀，Qiagen RNA病毒提取試劑盒、Qiagen RNA病毒純化試劑盒、HCV核酸定量檢測試劑盒均購自凱杰生物工程（深圳）有限公司。

3 方法

3.1 標本前處理：臨床收集50 mL HCV RNA載量為107IU/mL血清作為第一份血清，血站收集的兩份50 mL HCV陰性血清作為實驗稀釋液，從第一份血清中取0.75 mL加到50 mL陰性血清中，充分混勻后制成第二份血清，再從第二份血清取0.75 mL加入另一份50 mL陰性血清中，充分混勻制成第三份血清。等量倍比稀釋后經PCR定量檢測，3份HCV血清濃度分別為

1.18 ×107IU/mL、1.32×105IU/mL、1.88×103IU/mL作為本研究的3種初始濃度，將血清及其核酸經純化試劑盒純化后各分裝成45份分別儲存在25 ℃、4 ℃、-20 ℃條件下。隨后于1天、3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天分別取出不同溫度儲存的血清與核酸檢測病毒載量的變化情況，實驗重復3次，計算均值及標準差。

3.2 HCV RNA病毒載量檢測：采用凱杰生物工程（深圳）有限公司的HCV核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法）進行核酸提取和PCR擴增檢測。核酸提取與純化嚴格按照試劑盒說明書進行，同時設HCV陰性對照品、臨界陽性對照品、強陽性對照品。向1.5 mL的滅菌離心管中加入25 μL蛋白酶溶液，并加入待測樣本200 μL和新鮮配制的裂解液，充分混勻，于56 ℃水浴15 min。再加入250 μL無水乙醇，徹底混勻。15～25 ℃靜置5 min，轉入加套管的核酸純化柱，6 000 g離心1 min。倒掉套管中的廢液，將提取柱重新放入套管中。向核酸純化柱中先后加入500 μL洗液1、洗液2、無水乙醇，分別于6 000 g離心1 min，棄液，放入新的提取柱于套管中，棄套管。將提取柱放入新的收集管中，20 000 g離心3 min，徹底去除乙醇。棄收集管，將核酸純化柱放入干凈的1.5 mL離心管中，打開提取柱的蓋子，56℃水浴3 min。將核酸純化柱放入另一干凈的1.5 mL離心管中，加入60 μL洗脫液，蓋上蓋子，室溫靜置10 min。20 000 g高速離心1 min，收集濾出液，做好標記，4 ℃保存備用。提取的核酸在2 h內進行PCR擴增。PCR 擴增按照試劑盒說明書配置反應液，每個反應體系含有HCV RT-PCR反應液28 μL，酶混合物2 μL，待測樣品的核酸提取物20 μL，反應總體系50 μL。擴增和檢測參數為50 ℃ 30 min，95℃ 15 min，95 ℃ 15 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 15 s，熒光信號收集設在50 ℃，45個循環。擴增檢測根據設置的HCV定量標準品相應濃度由儀器軟件自動分析結果。

4 統計學處理 將樣本處理組及各時間點的檢測結果進行對數轉換，并計算均數和標準差。采用SPSS17.0軟件進行多個樣本與多個時間相關聯，采用多元球形檢驗，P＜0.05，差異有統計學意義。

結 果

1 血清H C V載量與儲存溫度及初始濃度的關系 血清H C V載量隨儲存時間的延長呈顯著變化（F=3 7 5.4 4 9，P＜0.0 5），差異有統計學意義，HCV載量隨儲存時間的延長呈現下降趨勢。血清HCV載量隨時間的變化與儲存溫度、初始濃度均相關（F=1.941，P＜0.05），差異有統計學意義。107IU/mL、105IU/mL、103IU/mL血清分別儲存在不同條件下1天、3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天后分別取出，在室溫條件下提取核酸和檢測其病毒核酸載量，進行不同濃度的血清樣本在相同儲存時間不同溫度下比較發現，107IU/mL、105IU/mL、1 03IU/mL三者間兩兩比較均存在顯著性差異（P＜0.05），HCV濃度越高其穩定性越好。4 ℃與-20℃儲存的血清HCV載量無顯著性差異（邊緣P值，P＝0.68＞0.05），兩者均與25 ℃儲存的血清HCV載量存在顯著性差異（P＜0.05）。如圖1所示，實驗表明4 ℃與-20 ℃儲存比25℃更好的保持HCV RNA的穩定性。 如圖1顯示，在25℃儲存條件下，103IU/mL、105IU/mL、107IU/mL HCV血清樣本分別存放9天、12天、35天后其載量趨于零，表明25 ℃儲存血清易造成HCV核酸的降解。

圖1 三種初始濃度HCV血清病毒載量在不同溫度下隨時間的變化

2 HCV純化核酸與儲存溫度關系 103IU/mL、105IU/mL、107IU/mL HCV純化核酸在25 ℃、4 ℃與-20℃存放70天，其結果如圖2所示，其濃度變化與初始濃度呈負相關（P＜0.05）。由圖2可見，隨著時間的延長，濃度越低的純化核酸會逐漸降解趨于零，103IU/mL的HCV純化核酸在25 ℃存放49天后降解趨于零，在4 ℃與-20 ℃存放56天后呈現顯著降解。而高濃度的107IU/mL HCV純化核酸隨時間的延長降解變化不明顯。

圖2 三種濃度HCV純化核酸在不同溫度存儲下隨時間的變化

討 論

核酸擴增技術由于靈敏性強、特異性高，能迅速再現血清或血漿病毒載量，已被廣泛應用于病原體載量的臨床檢測。由于HCV是一種RNA病毒，離體后易受外界環境的影響引起RNA降解，因此，標本采集后的保存條件對HCV檢出率有直接影響。

血清樣本病毒濃度與儲存溫度直接影響HCV的穩定性。BALERIOLA[5]、DAMEN[6]等研究證實，HCV RNA儲存在-70 ℃12個月甚至15個月仍然穩定。劉長利等[7]報道，血樣在4℃保存7～14天，其HCV RNA的檢出量變化不明顯。SENER[8]等研究表明，不同水平HCV RNA的血樣在4 ℃保存35天后，HCV RNA的檢出量變化不明顯，其穩定性與標本中HCV RNA含量呈正相關。我們通過研究臨床常見的107IU/mL、105IU/mL、103IU/mL HCV血清載量在不同儲存條件下隨時間變化的特點，發現103IU/mL、105IU/mL、107IU/mL HCV血清樣本分別在25℃存放9天、12天、35天后，其載量呈明顯的下降趨勢，且隨時間的延長，下降趨勢愈見明顯。曾有文獻[9]報道，血液中HCV RNA起始濃度較低，其穩定性越差，短時間常溫保存便會造成病毒核酸的降解，此結論與我們實驗的結果相符。與25 ℃儲存相比，4 ℃和-20 ℃能較好的保持HCV血清樣本的穩定。然而，4 ℃和-20 ℃儲存相比較，差異不顯著，為邊緣P值，我們今后將擴大樣本量、延長實驗周期進一步研究。

HCV純化核酸濃度對其穩定性有直接影響，隨著時間的延長，儲存溫度的影響更加顯著。有文獻[10]報道，HCV核酸在室溫（25 ℃）和4 ℃中儲存至少3天以上依然穩定。JOSE′等[9]人的研究表明，HCV和HIV RNA儲存在-20℃中超過5年的核酸載量沒有明顯變化。近年有文獻[11]報道純化的HCV RNA及HIV RNA在2～8 ℃條件下至少可以保存7天。本實驗中HCV純化核酸在25 ℃、4 ℃與-20 ℃條件下儲存70天其濃度變化與初始濃度呈負相關。

由于RNA結構的特殊性，研究HCV血清及其純化核酸的穩定性和影響因素對血液篩查具有深遠的意義。臨床檢測HCV載量可提示病毒復制能力，對了解疾病的自然進程起著至關重要的作用。獻血者中潛在的HCV感染者，大部分是“窗口期”低病毒載量且易漏檢的感染者，嚴重威脅血液制品的安全。優化血液標本運輸條件和儲存方法，對獲得準確的病毒載量、防止“窗口期”漏檢、保障血液制品安全具有重要意義。通過上述的研究結果表明，4 ℃與-20 ℃保存HCV血清，能更好地保持樣本的完整性。我們在實際工作中，應保證樣本在4 ℃或-20 ℃運送與保存，如未能及時檢測，需盡早提取并純化核酸，保證其檢測結果符合病毒的真實載量，有效鑒別“窗口期”的潛在感染者。

致謝我們由衷地感謝解放軍總醫院第五醫學中心臨檢中心及全軍傳染病研究所臨床研究管理中心的技術支持與實驗指導！

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突