新生兒溶血病發病機制及產前診斷研究進展*

陳清艷 王秋實

胎兒和新生兒溶血病 （hemolytic disease of fetus and newborn，HDFN） 是由于母親與胎兒血型不合，母親體內產生針對胎兒血型抗原的特異性血型抗體，通過胎盤進入胎兒血液循環，致敏胎兒紅細胞導致胎兒或新生兒發生同種免疫性溶血，主要引起貧血、黃疸、水腫、肝脾腫大等臨床癥狀[1]，嚴重時可發展為核黃疸甚至死亡[2]。隨著我國開放計劃生育政策，多次妊娠引起的HDFN發病率逐漸增多，也逐漸受到臨床重視，現就HDFN的發病機制和風險預測綜述如下：

1 HDFN流行病學特點 ABO血型系統和Rh血型系統抗體是引起HDFN的主要血型系統，其中ABO血型不合引起的HDFN在我國最常見，主要為抗-A/B抗體。抗-A/B抗體多為天然的IgM抗體，O型血母親在妊娠前可通過暴露于類血型物質產生IgG性質的抗-A/B抗體，數據顯示O-A母嬰血型發病率高于O-B母嬰血型，第一胎即可發病，臨床癥狀一般較輕，主要以黃疸為主[3-4]。

Rh血型系統抗體產生主要與輸血和妊娠相關，Rh血型系統HDFN多為第二胎發病，由于現在常規檢測D抗原，輸血時采取同型輸注的方式，D抗原陰性人群在亞洲人中比例低，抗D免疫球蛋白應用也逐漸增加，因此目前抗-D抗體引起HDFN明顯降低。由于目前未推廣E和C抗原配合輸注，E和C抗原在人群中分布差異較大，Rh系統其他抗體如抗-E，抗-c抗體引起HDFN逐漸增多[5]。MN血型不合導致的HDFN與ABO血型系統類似，第一胎就可以發病，但是發病率明顯低于ABO和Rh血型系統。目前已經報道的其他可能引起HDFN的稀有血型系統抗體還有Kidd系統、Duffy系統和Kell系統，但這些血型系統所致的HDFN病例較少。

2 HDFN發病機制 截止到2021年，ISBT（國際輸血協會）已經確定43個紅細胞血型系統，包含376個人類紅細胞抗原，不同的紅細胞抗原具有不同的結構和功能。血型抗原根據抗原決定簇可以分為糖類抗原和多肽抗原，ABO等糖類抗原對應產生IgM抗體，多肽抗原對應產生IgG抗體，例如HDFN相關的Rh、Kell、Duffy、Kidd和MNS均屬于此類抗原。紅細胞同種免疫抗體的產生涉及多種影響因素，例如抗原結構、抗原密度、炎癥狀態、抗原提呈能力、抗體分型、抗體通過胎盤的能力均可以影響抗體的產生以及抗體對胎兒紅細胞的破壞能力。

2.1 紅細胞同種異體抗體形成機制

2.1.1 抗原特征：人類血型系統具有多態性，其抗原表達量和抗原免疫原性在臨床疾病中具有重要意義。ABO血型系統的A、B等位基因編碼合成相應的糖基轉移酶，A、B糖基轉移酶作用于前體物質，催化不同類型的糖鏈生成而產生A、B抗原[6]。ABO血型系統抗原具有極強的免疫原性，ABO亞型由于蛋白編碼區單核苷酸變異、內含子或啟動子區域的變異致抗原表達減弱[7-8]。Rh血型系統的重要性僅次于ABO血型系統，分別由RHD基因和RHCE基因編碼產生D、C、c、E、e五種抗原，其中C/c和E/e屬于對偶抗原[9]。研究還發現Rh抗原的表達存在“劑量效應”，純合子基因比雜合子基因個體表達更多的抗原[10]。另外，RHD基因編碼區的堿基突變可以導致RHD蛋白氨基酸發生替換，產生弱D表型，表現為RhD抗原表達量明顯減少，誘導機體產生抗體的能力減弱或者消失[11-12]。動物和人類研究中顯示密度極高的抗原比密度適中的抗原免疫原性弱，而密度極低的抗原相對免疫原性更弱[13-14]。

2.1.2 抗原提呈能力：抗原提呈是抗原提呈細胞將抗原肽提呈給T細胞，誘導T細胞活化的過程。目前研究已經證實紅細胞同種免疫中非自身紅細胞抗原提呈與人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分子有關，HLA基因復合體編碼的HLA分子識別提呈外源性抗原肽與T細胞結合。有研究表明HLA-DRB1基因在第一次紅細胞反應中起著重要作用，其中抗-D的產生與HLA-DRB1*01基因具有明顯相關性，但是患者一旦產生紅細胞抗體，再次接觸紅細胞抗原產生額外抗體的機會就增加[15]，有學者認為多重紅細胞抗體形成與HLA-DRB1*15基因相關[16]。HLA等位基因作為決定人體對紅細胞抗原易感程度的重要基因，多種不同的HLA分子可以提呈具有臨床意義的紅細胞抗原。

2.1.3 免疫細胞的調節作用：T細胞是人體內重要的免疫細胞，活化后分化為Th1、Th2、Th17、調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）和濾泡輔助性T細胞（follicular helper T cell，Tfh）等不同的亞型，通過分泌免疫因子以及表面表達活化性或抑制性免疫受體對免疫應答進行調控。Treg細胞是T細胞亞群中的一類負性調節T細胞，活化后可以下調免疫應答從而減弱機體的免疫反應程度，在發生紅細胞同種免疫的鐮狀細胞貧血病（sickle cell disease，SCD）患者中觀察到外周血中Tregs活性降低，以及細胞因子IFN-γ表達水平升高，IL-10降低，Th1和Th2之間的免疫平衡被破壞[17]。另外，還有研究發現SCD患者由于長期處于溶血狀態下，體內產生的血紅素可以通過抑制DOCK8/STAT3信號通路從而抑制漿細胞的免疫功能，但是已經發生了同種免疫的SCD患者的B淋巴細胞對血紅素的抑制作用無反應[18]。

Tfh是一類表型分化簇4 （cluster of differentiation 4，CD 4）和C-X-C基序趨化因子受體5（C-X-C motif chemokine receptor 5，CXCR5）雙陽性的T細胞亞群，是B淋巴細胞效應的主要輔助細胞[19]。CD4+T細胞經抗原活化后表達誘導性協同共刺激分子ICOS，與B淋巴細胞表面的可誘導性共刺激分子配體ICOSL結合，誘導CD4+T細胞進一步分化為高表達趨化因子受體5（CXCR5）的Tfh。Tfh分泌的IL-4和IL-21誘導B淋巴細胞分化為漿細胞產生抗體[20-21]。多項研究證實Tfh細胞功能異常與多種疾病相關，GODEFROY[22]等發現發生同種免疫的SCD患者的Tfh表面表達一種含Ig及免疫受體酪氨酸抑制基序ITIM 結構域的T細胞免疫受體（TIGIT），與缺乏TIGIT的Tfh相比，表達該受體的Tfh上調共刺激分子和產生更高水平的IL-21，導致產生的紅細胞同種抗體增加，在紅細胞同種免疫的發病機制中起重要作用。

動物研究模型中進一步闡述了CD40/CD40L相互作用[23]、1型干擾素[24]、補體[25]和橋接通道樹突狀細胞[26]對誘導紅細胞抗體產生的作用。

2.1.5 受體炎癥狀態：小鼠模型中證實IL-6對輸血導致的同種免疫具有調節作用，T細胞表面表達IL-6受體信號驅動紅細胞同種免疫小鼠模型中紅細胞同種抗體的產生和CD4+T細胞分化為Tfh[27]。現在基于人類患者的研究也顯示受體的炎癥狀態與紅細胞同種免疫發生有關，據報道SCD、炎癥性腸病和自身免疫性疾病等患者在輸血過程中誘導紅細胞同種免疫發生的風險都顯著增高，SCD患者發生急性胸痛綜合征和血管阻塞危象與紅細胞同種抗體的產生緊密相關，炎癥性腸病患者在輸血過程中發生紅細胞同種免疫的概率是未患炎癥性腸病人群的3.5倍[28-29]。

2.1.6 機體免疫耐受：臨床中發現不是所有暴露于非自身紅細胞抗原的受血者和孕婦都會發生紅細胞免疫應答，只有少數產生了可檢測到的紅細胞同種抗體。免疫 “應答者”的全基因組關聯研究中顯示不存在易感基因位點[30]。有人提出這類“無應答者”可能存在免疫耐受，在某些條件下對非自身抗原不發生反應，NATRAJAN等[23]通過CD4+T細胞耗竭或阻斷CD40L在小鼠體內成功誘導了紅細胞血型抗原免疫耐受的模型，證明了抗原特異性耐受的存在。由此可見，關于免疫“無應答者”的發生機制，以及在孕婦妊娠過程中是否發揮了保護作用值得進一步研究。

2.2 抗體進入母體作用機制

2.2.1 抗體分型：人體內免疫球蛋白分為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE五大類，其中IgG在人體血清中含量最高，也是唯一可以通過胎盤導致HDFN的抗體。IgG分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四個亞型，其鉸鏈區氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數目、位置不同決定其具有不同的效應功能：激活補體的能力依次為IgG3＞IgG1＞IgG2，IgG4無激活經典途徑的能力[31-32]，IgG1和IgG3優先通過胎盤屏障[33-34]。HDFN發病風險與血清中的IgG1含量相關，當 IgG3與IgG1同步升高時，提示嚴重的HDFN[35]。另外，有文獻顯示HDFN患者溶血程度與特異性血型抗體Fc區域的多糖修飾相關，低巖藻糖基化的IgG1可以增強與FcγRIIIa受體的親和力[36]，在NK細胞介導的細胞吞噬中發揮重要作用，導致HDFN患者溶血程度加重[37-38]。

2.2.2 胎盤轉運能力：胎盤作為母體和胎兒進行物質交換的橋梁，其合胞體滋養層細胞表達的新生兒Fc受體（neonatal FcR，FcRn）的結構與MHC-I分子類似，可以介導母體IgG以pH依賴的方式與其結合從而轉移到滋養細胞層進入胎兒血液循環[39]。IgG抗體的胎盤轉運效率還與抗體Fc區域的多糖修飾有關，GALIT ALTER[40]和SALLIE R. PERMAR[41]等

發現雙半乳糖化的抗體更易通過胎盤從而驅動NK細胞的脫顆粒效應和細胞因子分泌。雖然目前的研究證明IgG抗體Fc區域的不同糖基化水平與胎盤轉運相關，但是具體作用機制仍不明確。

2.3 紅細胞破壞機制：HDFN是發生在胎兒或新生兒時期的疾病，抗體如何通過胎盤引起同種免疫性溶血是其發病關鍵。目前認為主要有兩種機制：一是IgG抗體通過胎盤進入胎兒血液循環后作用于胎兒成熟紅細胞并與紅細胞表面抗原結合，繼而致敏紅細胞被單核-巨噬細胞系統破壞，發生溶血反應。二是HDFN的發生與胎兒或新生兒紅細胞生成抑制有關，研究發現Kell和MNS血型系統（抗-K、抗-M）相關的新生兒溶血病主要破壞紅系祖細胞，妊娠12周之前就有可能引起胎兒貧血，引起胎兒造血異常，但是不會發生紅細胞代償性增加[42-43]。

3 HDFN產前風險評估

3.1 父母血型鑒定：胎兒遺傳自父系紅細胞血型抗原與母體血型不合是發生HDFN的高風險因素，孕婦應在妊娠8～12周建檔和孕齡28周時進行ABO和RhD血型鑒定。ABO血型不合所致的HDFN在國內最常見，通過父母血型鑒定提前評估胎兒發生HDFN的風險，對高風險人群采取預防措施。雖然ABO血型和RhD血型系統不合都與HDFN相關，但是二者同時存在時，ABO不相容性會降低D抗原免疫的風險[44]。

3.2 胎兒血型預測

3.2.1 有創基因檢查：有創基因檢查通過臍靜脈穿刺、羊水穿刺和絨毛活檢等侵入性產前診斷技術直接取樣獲取胎兒DNA進行胎兒血型鑒定，但是這些檢查技術可能導致紅細胞同種免疫、心動過緩甚至流產等嚴重的并發癥，羊膜穿刺術后所導致的流產風險為0.3%[45-46]。目前在臨床已較少應用，而無創的基因檢測方法才是未來預測胎兒血型主要手段。

3.2.2 無創基因診斷（NIPT）：1997年，盧煜明教授[47]等在孕婦血漿和血清中發現了少量胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA），為NIPT的建立提供了理論基礎。1998年，LO[48]等采用實時熒光定量PCR發現孕婦血漿中的cffDNA含量從第五周開始逐漸增多。SMID[49]等研究發現在分娩后2天內，105名婦女中有47名（45%）血漿中存在很低濃度的可檢測的胎兒DNA，但未發現cffDNA長期存在的證據。YU[50]等通過大規模平行測序對cffDNA進行測定可精確觀察到胎兒DNA在分娩后分兩個階段被快速清除，半衰期分別為1h和13h，并通過快速配對末端測序證實孕婦血漿中胎兒的DNA片段短于來自母體的DNA片段。這一系列研究說明cffDNA是臨床進行NIPT的可靠標志物。FINNING[51]等在RhD陰性孕婦妊娠28周時采用自動化技術分離孕婦血漿中的胎兒DNA，通過高通量方法預測胎兒RhD表型的準確率達到95.7%。英國血液學標準委員會（BCSH）的指南中提出在妊娠≥16周或更晚時分離母體血漿cffDNA進行RhD基因分型敏感性更高[52]。CHITTY[53]等的隊列研究顯示在妊娠11周時足以通過胎兒DNA預測RhD類型。目前一些歐洲國家已經通過cffDNA來確定胎兒RhD血型，用于避免不必要的產前抗D免疫球蛋白（Rh immune globulin，RhIG）的使用和產后預防的指導。荷蘭[54]、丹麥[55-56]、瑞典[57]、法國[58]和加拿大[59]等國家已經在臨床開始實施NIPT進行胎兒血型RhD分型。

國內外對cffDNA進行RhD分型已經做了大量研究，但由于cffDNA在母體血漿中的含量極少，其性質與母體來源的DNA高度相似，目前尚無進行統一的提取方法。2020年，盧煜明教授[60]等提取了孕婦血漿中的染色體外環狀DNA（eccDNA）進行檢測，發現胎兒來源的eccDNA片段和cffDNA片段一樣，短于母體來源的eccDNA，但是其穩定性更高，有可能會成為新一代標志物。NIPT作為無創DNA檢測領域一大進步，針對RhD血型進行的研究較多，對ABO血型系統關注相對較少，如果未來想在臨床普遍應用仍需要繼續探索。

3.3 孕婦紅細胞不規則抗體篩查：美國婦產科學院（ACOG）建議所有孕婦在第一次產前檢查時進行常規篩查，以評估產婦血型（ABO）、RhD和其它不規則抗體[61]。MNS血型系統中抗-M的最佳反應溫度在4℃，曾經被認為沒有臨床意義，不過近年來不斷有抗M相關病例報道，發現其通過破壞紅系祖細胞引起的HDFN伴有低再生性貧血，導致早期流產和胎兒水腫的風險增加[43]。國內外也有報道其他罕見IgG類抗-PP1Pk[62]、抗-Hr0[63]抗體引起的HDFN。目前已經報道可能引起HDFN的稀有血型系統抗體有Rh系統、Kidd系統、Duffy系統、Kell系統、MNS系統。

3.4 抗體效價監測：抗體效價監測可以反映孕婦體內抗體水平變化，提示發生HDFN的風險，但是目前國內實驗室無國家標準物質對照檢測，與國外存在一定差異。國內相關孕期管理中指出孕婦為RhD陰性或孕婦為O型，丈夫為非O型者在妊娠12～16周進行第一次檢測，作為抗體基礎水平，高效價IgG抗-A、抗-B或ABO以外抗體，建議在妊娠28周前每月進行一次抗體檢測，妊娠28周至分娩前每2～4周檢測一次；抗-D≤16， 每4周做一次抗體效價測定，抗體效價 ≥32， 每2周一次[64]。孕期IgG抗-A/B效價大于64時患HDFN的風險增加，應進行產前干預降低抗體效價[65]。

國外認為ABO血型系統引起嚴重的HDFN較少，不推薦進行抗體效價檢測。英國發布的指南中指出妊娠8～12周進行第一次檢測，檢出抗-D、抗-c和抗-K等具有臨床意義抗體時進行定量分析，妊娠2 8周前每四周一次，妊娠28周至分娩前每兩周一次，胎兒娩出后立即行直接抗人球蛋白實驗、血紅蛋白和膽紅素檢測進行確診，初次抗體篩查未檢出具有臨床意義的抗體的孕婦需在妊娠28周時重復抗體篩檢，陰性無需處理[66-67]。國外對妊娠期抗-D的管理也進行了明確規定：檢出抗-D小于4 IU/mL時進行臨床觀察；4～15 IU/mL提示中度HDFN；大于15 IU/mL提示重度HDFN，建議轉入胎兒醫學專科治療[67]。

抗-K作為一種與嚴重的HDFN相關的抗體，其效價監控目前仍有爭議，一般將臨界值規定為32，但在效價很低時下也有可能導致嚴重的HDFN，英國和美國將臨界值定為＜32，也有人建議應將抗-K的臨界值效價定為4，孕期任何時候檢測到都需及時行超聲檢查確定胎兒是否發生貧血和水腫[68]。其他血型系統抗體尚沒有統一抗體效價閾值，但是已有37℃下效價為1的抗M引起嚴重HDFN的報告，因此也有人認為非ABO血型系統抗體檢出就有意義[69-70]。

3.5 IgG抗體亞型鑒定：孕期IgG抗體水平不能作為HDFN發病唯一標準，有些孕婦血清中抗體效價＞1∶64或者更高時，胎兒并未出現溶血癥狀。研究證實孕婦血清中IgG各亞型的含量與HDFN相關，目前國內主要通過流式細胞術和ELISA進行IgG抗體亞型鑒定，但是這兩種檢測試劑價格昂貴且操作時間長，不利于臨床推廣。近幾年有人提出采用微柱凝膠技術進行IgG抗體亞型鑒定的實用性更強，但是其敏感性有待提高[71-72]。

3.6 抗體活性鑒定：抗體篩查和抗體效價檢測是臨床預測發生HDFN風險的常見方法，但是這些方法只能證明體內存在抗體并不能反映抗體免疫活性。進一步的抗體活性鑒定可以預測可檢測的紅細胞同種抗體的臨床意義，主要包括抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 （antibody-dependent cellmediated cytotoxicity，ADCC）實驗和單核細胞單層測定（monocyte monolayer assay，MMA）[73-74]。紅細胞的破壞程度與抗體活性密不可分，之前的研究證實單核細胞相關的ADCC是預測紅細胞破壞最敏感的實驗方法[75]。MMA可以模擬人體內免疫反應，直觀地反應致敏紅細胞被單核細胞吞噬情況[76]，對預測體內低效價的抗體是否導致HDFN具有指導意義。

3.7 超聲檢查：胎兒大腦中動脈多普勒評估是預測胎兒貧血的最佳無創工具，胎兒貧血時由于血液粘稠度降低，MCA-PSV速度增快[77]。胎兒保持平靜狀態下，于大腦中動脈起始部測量可以避免MCA-PSV的中位數倍數（multiple of the median， MoM）測值過高。目前國際上主要采用MARI[78]等制定的參考標準：MCA-PSV=1.0 MoM為妊娠時正常平均值；MCA-PSV＞1.5 MoM時胎兒存在中高度貧血風險，每2～3天復查一次；MCA-PSV持續＞1.5 MoM時，需行臍靜脈穿刺采樣檢查，必要時行宮內輸血治療；高危孕婦（抗-D、抗-c 和抗-K的效價高于風險臨界值）從孕16～18周開始每周復查。超聲檢查方法除監測MCA-PSV外，還能更加直觀地觀察胎兒水腫、肝脾大及羊水量和生長發育狀況。

4 總結 綜上所述，紅細胞破壞主要與胎母血型不合所引起的抗原抗體反應以及破壞胎兒紅系祖細胞有關，溶血反應的嚴重程度與紅細胞同種抗體的特異性、功能活性以及抗體靶向抗原在胎兒紅細胞上的表達相關。父母血型鑒定、孕期抗體篩查、ADCC、MMA和MCA-PSV都有利于進行風險評估，基于cffDNA的NIPT可以預測RhD血型，減少不必要的RhIG應用同時避免了侵入性操作可能造成的并發癥。機體免疫狀態在紅細胞免疫過程中發揮十分重要的作用，盡管多種免疫分子已經證明與紅細胞同種免疫有關，但是與紅細胞同種抗體產生相關的作用機制尚未完全闡明。孕婦妊娠過程中的免疫狀態調節是否是誘發HDFN的關鍵因素，有待進一步研究。

利益沖突作者聲明不存在利益沖突