核酸檢測反應性獻血者歸隊方案探討*

任亞娜 周國平

我國從2010年起在血站系統逐漸開始血液篩查NAT（nucleic acid testing，NAT）試點工作，目前已基本實現了全面覆蓋，它在血液篩查方面的優勢也越來越明顯。但是與酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）一樣，用高靈敏度的核酸篩查試劑檢測健康的獻血者，必定存在假反應性結果。假反應性的原因包括試劑、獻血者自身和技術等導致檢測信號非正常上升的因素，乙肝、丙肝等核酸篩查試劑的假反應性結果，國內外均有文章報道[1-3]。基于有效保護獻血者的權利，珍惜有限的血液資源，歐盟、英國、美國均已相繼制定了核酸反應性獻血者屏蔽與歸隊指南[4-8]。我國已制定團體標準血液篩查反應性獻血者歸隊指南[9]，但核酸反應性獻血者的相關方案還沒有納入歸隊指南中，需要進一步探討和研究。本研究通過對NAT反應性獻血者再召回進行檢測，并增補化學發光免疫分析法（chemiluminescent immunoassay，CLIA），初步確定歸隊結果判斷規則，設計了核酸反應性獻血者歸隊方案供開展歸隊工作的血站探討參考。

資料與方法

1 材料

1.1 研究對象：篩選上海市血液中心2012年～2017年ELISA無反應性、HBV-DNA、HCV-RNA、HIVRNA反應性獻血者，間隔至少6個月后進行召回，每輪召回收集血液樣本15 mL，分別采集在2支酶免管和1支核酸管中。

1.2 試劑：乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗原抗體、梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒（酶聯免疫法）（上海科華生物工程股份有限公司，Diasorin S.p.A. UK Branch，Ortho-Clinical Diagnostics, Inc，廈門新創科技有限公司，珠海麗珠試劑股份有限公司）以及相關血清（液體）標準物質（北京康徹思坦生物技術有限公司）。NAT試劑：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1+2型）核酸檢測試劑（PCR-熒光法）（Roche Molecular Systems, Inc）以及相關質控品（北京康徹思坦生物技術有限公司）。HBsAg、HBeAg、Anti-HBs、Anti-HBc、Anti-HBe、Anti-HCV、Anti-HIV化學發光免疫分析法試劑以及相關質控品（Roche Molecular Systems, Inc）。

1.3 設備：Microlab STAR全自動加樣系統（HAMILTON BonaduzAG）；Freedom Evo Clinical免疫分析加樣系統（Tecan Schweiz AG）；MicrolabF.A.M.E. 全自動酶免分析儀（HAMILTON Bonaduz AG）；COBAS AmpliPrep全自動核酸分離純化系統 （羅氏診斷產品（上海）有限公司）；COBAS TaqMan系統（羅氏診斷產品（上海）有限公司）；COBAS e411全自動電化學發光免疫分析儀（羅氏診斷產品（上海）有限公司）。

2 方法

2.1 ELISA和NAT（PCR-熒光法）：嚴格按照ELISA試劑盒說明書要求對血液標本進行乙肝病毒抗原、丙肝病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗原抗體和梅毒螺旋體抗體檢測。四個項目都利用兩種廠家的試劑，進行兩遍檢測以及反應性雙孔復檢。嚴格按照乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1+2型）核酸檢測試劑盒說明書對標本進行乙肝病毒DNA、丙肝病毒RNA、人類免疫缺陷病毒RNA單檢。室內質控結果符合檢驗科室內質控要求，并按照血站技術操作規程判斷ELISA和NAT結果。

2.2 CLIA（電化學發光法）：嚴格按照試劑盒說明書進行全自動電化學發光免疫分析儀儀器校正及羅氏配套定標液進行試劑的定標，乙肝兩對半（HBsAg、HBeAg、Anti-HBs、Anti-HBc、Anti-HBe）、丙肝病毒抗體（Anti-HCV）、人類免疫缺陷病毒抗體（Anti-HIV）共7個項目定標完成后進行相應項目的檢測。質控品分析程序，采用相應項目配套質控品監測實驗的可控。

結 果

1 第一輪召回ELISA和NAT結果 第一輪共召回42人，其中HBV-DNA反應性獻血者37人， HCV-RNA反應性獻血者4人，HBV-DNA反應性且HCV-RNA反應性獻血者1人。第一輪召回的獻血者樣本先通過血清學檢測方法（兩遍ELISA）和核酸檢測方法（NAT單檢）進行歸隊檢測標志物（HBV、HCV、HIV和TP）的檢測。41位獻血者中檢測結果為ELISA無反應性/NAT反應性的15人（占64.3%），ELISA無反應性/NAT無反應性的26人（占35.7%）。其中HBV-DNA反應性且HCV-RNA反應性的該位獻血者第一輪召回檢測結果為ELISA 無反應性/NAT 無反應性（表1）。

表1 核酸反應性獻血者第一輪召回檢測結果

2 第一輪召回CLIA結果 第一輪召回檢測為ELISA無反應性/NAT無反應性的獻血者（27人），再采用CLIA檢測乙肝五項、Anti-HCV和Anti-HIV，結果如下。9人（占33.3%）化學發光結果為Anti-HBc反應性/Anti-HBe反應性、14人（占51.9%）化學發光結果為Anti-HBc反應性、4人（占14.8%）CLIA結果為7項檢測全部為無反應性（表2、表3）。其中HBVDNA反應性且HCV-RNA反應性的該位獻血者化學發光結果為Anti-HBc反應性。

表2 ELISA無反應性/NAT無反應性獻血者化學發光法檢測結果

表3 HBV-DNA、HCV-RNA反應性獻血者化學發光檢測結果

3 第二輪召回檢測結果 至少間隔6個月進行第二輪召回，召回的18人第一輪檢測為ELISA無反應性/NAT無反應性/CLIA無反應性的1人、 ELISA無反應性/NAT無反應性/CLIA反應性的10人、 ELISA無反應性/NAT反應性/CLIA 反應性的7人。召回后進行兩遍ELISA和NAT單檢，而且進行了CLIA試驗，結果見表4。其中有1人第一輪檢測結果ELISA無反應性 /NAT無反應性/CLIA反應性，而第二輪檢測結果HBV-NAT轉為反應性；1人第一輪檢測結果ELISA無反應性/NAT反應性/CLIA反應性，而第二輪檢測結果為NAT無反應性。其余的第一輪和第二輪檢測結果一致。

表4 第二輪召回檢測結果

4 歸隊方案的初步設計 根據實驗結果，初步設計了HBV NAT和HCV NAT反應性獻血者歸隊方案：第一輪召回檢測為ELISA反應性/NAT反應性和ELISA反應性/NAT無反應性的獻血者，兩種ELISA試劑均為反應性的建議永久屏蔽；ELISA無反應性/NAT反應性獻血者暫時屏蔽，屏蔽一段時間（如6個月）可進入第二輪歸隊流程；ELISA無反應性/NAT無反應性獻血者若CLIA中任一項反應性（除Anti-HBs）則建議永久屏蔽；ELISA無反應性/NAT無反應性獻血者CLIA所有項目均無反應性獻血者建議可以歸隊（圖1）。第二輪召回檢測ELISA、NAT和CLIA若有任一項反應性（除Anti-HBs）建議永久屏蔽；召回檢測結果均為無反應性的獻血者，建議可以歸隊（圖2）。

圖1 HBV、HCV NAT反應性獻血者第一輪歸隊流程圖

圖2 HBV、HCV NAT反應性獻血者第二輪歸隊流程圖

討 論

核酸反應性的血液報廢，核酸反應性獻血者永久屏蔽，在保護受血者的安全起到積極的作用，但隨著核酸檢測在血篩領域的廣泛應用，也有許多獻血者因核酸假反應性結果被永久屏蔽。因此，核酸反應性獻血者歸隊問題也漸漸引起了國內外血站的關注。在廣泛參考歐盟、美國、英國等發達國家的相關標準，并且充分考慮我國的國情，制定核酸反應性獻血者屏蔽或召回流程，為開展相關工作提供一個技術途徑。我國關于NAT反應性獻血者歸隊問題及方案目前研究的還很少，大多只有對獻血時采集的樣本進行進一步的實驗研究[10-11]。有血站已在進行獻血者歸隊工作，但未進行相應的如化學發光等補充試驗[12-13]。

本研究初步設計HBV、HCV NAT反應性獻血者歸隊方案：召回符合條件的獻血者，采集標本后采用原來的以及更為靈敏的檢測方法（CLIA）檢測。本研究采取原來的ELISA檢測試劑和方法以及核酸檢測單檢模式。實驗結果顯示，64.3%的獻血者第一輪召回檢測結果為ELISA無反應性/NAT無反應性，可能存在上次獻血篩查假反應性，然后通過CLIA作為補充實驗。第一輪召回檢測結果為ELISA無反應性/NAT無反應性進行化學發光實驗，85.2%為Anti-HBc反應性和/或Anti-HBe反應性，且結果顯示第一輪Anti-HBc和/或Anti-HBe反應性者第二輪仍為反應性。有文章報道，將乙肝ELISA無反應性/NAT反應性獻血者標本，進一步分析發現大多為HBV隱匿性感染[14-15]。隱匿性乙肝感染發生機制與乙型肝炎病毒變異密切相關，是輸血傳播乙肝病毒的潛在危險；Anti-HBe反應性標本，可能為近期感染或急性恢復期或感染已恢復。因此，建議ELISA無反應性/NAT無反應性/CLIA反應性獻血者在第一輪永久屏蔽。

本研究中有1例ELISA無反應性/HBV-NAT反應性獻血者第一輪召回檢測結果為ELISA無反應性/HCV-NAT反應性且ALT不合格，首先懷疑是否存在HCV感染窗口期。6個月后又召回進行檢測，ELISA無反應性/NAT無反應性、ALT正常，考慮可能為獻血者自身原因導致的檢測信號的假性升高。另外，結果顯示4例ELISA無反應性/HCV-RNA反應性的獻血者化學發光檢測結果有1例Anti-HBc/Anti-HBe反應性、1例Anti-HBc反應性，考慮是否有重疊感染或因獻血者自身原因導致的檢測信號的假性升高。為了血液安全考慮，建議核酸反應性獻血者若化學發光乙肝五項或丙肝抗體有任一項反應性（除Anti-HBs）則屏蔽。化學發光實驗中14.8%為所有項目均無反應性，可準許其解除屏蔽，再次參加獻血的程序。

35.7 %獻血者第一輪召回檢測仍為ELISA無反應性/NAT反應性，建議6個月后進入第二輪歸隊檢測。第二輪歸隊檢測為ELISA無反應性/NAT無反應性且CLIA無反應性的獻血者，建議也可回歸獻血者隊伍；若ELISA、NAT或CLIA任一項有反應性，建議永久屏蔽。按照本研究初步設計的NAT反應性獻血者歸隊流程，本次的研究對象42人中4人（占9.5%）的NAT反應性獻血者召回后，檢測結果符合歸隊條件，可解除屏蔽回歸獻血者隊伍。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突