38例血清學弱D表型獻血者RhCcEe表型與RHD基因型檢測情況分析*

吳凡 梁爽 彭龍 蘇宇清 梁延連 莊乃保

Rh血型系統是人類最復雜的血型系統。在臨床輸血中，Rh血型系統的重要性僅次于ABO血型系統。其中D抗原具有很強的免疫原性，是Rh血型系統中最主要的抗原。臨床上根據個體是否存在RhD抗原分為RhD陽性和RhD陰性。大部分個體的RhD抗原采用直接試管法即可檢出。少部分用直接試管法檢測為陰性，通過間接抗人球蛋白試驗才可檢出，這些個體為血清學弱D表型或RhD變異型（包括弱D、一些部分D等）。我們收集38例直接試管法檢測陰性，微柱凝膠卡間接抗人球蛋白法檢測陽性的血清學弱D表型獻血者血液樣本進行RhCcEe表型與RHD基因型分析，研究深圳地區血清學弱D表型獻血者RHD基因多態性。報道如下。

材料與方法

1 一般資料 篩選2019年4月～2021年2月深圳市血液中心85 862名首次獻血者中直接試管法檢測RhD陰性樣本，血樣于靜脈采集5 mL，4 ℃保存于EDTA抗凝管中。

2 試劑與儀器 抗-D IgM+IgG血型定型試劑（批號：517178）為加拿大Dominion公司產品；anti-D（批號：BMI1804B）為英國Millipore公司產品；抗-D單克隆IgG抗體、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e單克隆IgM抗體血型定型試劑、抗IgG，C3d抗人球蛋白檢測試劑（批號分別為：20190826、20193001、20193101、20193202、20183302、20195001）為上海血液生物公司產品；樣本稀釋液（ID-Diluent 2，批號：057610001）和微柱凝膠低離子抗人球蛋白卡（LISS/Coombs，批號：50531.48.17）均為美國Bio-rad 公司產品；DNA提取試劑盒（Blood DNA Purification Kit，批號：106412）為美國Promega 公司產品；人類紅細胞RhD血型變異體基因分型試劑盒（批號：K202005004）為天津秀鵬公司產品。KA-2 2 0 0免疫血液學用離心機為日本KUBOTA公司產品；ID-Incubator 37 SI保溫箱和ID-Centrifuge 12 SII臺式離心機均為瑞士Diamed AG公司產品；MAXWELL 16 DNA提取儀為美國Promega 公司產品；ProFlex PCR System為美國Life technologies公司產品； EP-1 0 1 9電泳儀為美國Embitec公司產品；FluorChem R 多功能成像分析系統為美國ProteinSimple公司產品。

3 方法

2.2.6.3 發病條件。土壤溫度和含水量是影響光葉紫花苕斑枯病2個主要的環境因素。該病的最適生長溫度為25～30 ℃。春旱、秋澇，發病較嚴重。

4RHD基因外顯子測序分析 對5例PCR-SSP法無法識別RhD變異型的樣本進行RHD基因的所有外顯子測序。測序結果顯示，其分別為R H D*w e a kD type 95（c.730G＞C，p.Ala244 Pro）；RHD*D C C（c.6 7 7 C＞A，p.A l a 2 2 6 A s p）；R H D*DFR 1（c.5 0 5A＞C、c.5 0 9T＞G、c.5 1 4A＞T，p.Met 1 6 9Leu、p.Met 1 7 0Arg、p.Ile 1 7 2Phe）；RHD*weak D type 50（c.727T＞A，p.Tyr243 Asn）以及RHD*IVS9-1C（c.1228-1G＞C）（表2）。其中RHD*weak D type 50在中國漢族人群中首次發現。RHD*IVS9-1C為RHD基因第9內含子-1位的純合突變（c.1228-1G＞C）尚未被ISBT（International Society of Blood Transfusion，國際輸血協會）數據庫收錄。該等位基因的序列數據已提交GenBank，登記號為MT755965。另外RHD*weak partial 15 /RHD*DEL1雜合型經測序再次確認（圖3）。5RHD雜合型分析 38例樣本中37例樣本可檢出Rh融合盒子，1例RHD*weak partial 15/RHD*DEL1雜合型樣本未能檢測出Rh融合盒子（圖4，表2）。

在處理城市精明增長與蔓延發展的關系時，最重要的就是把握城市建設發展中二者的“度”，從而更好地實現城市可持續發展。下文筆者繼續從城市規模角度入手，列舉正確把握精明增長與蔓延發展關系的相關建議：

3.2 基因組DNA提取、PCR擴增及RHD基因檢測：取300 μL全血加入Blood DNA Purification Kit DNA提取試劑盒樣本槽中，采用MAXWELL 16 DNA提取儀自動化提取全血DNA。每份DNA 溶于300 μL DNA buffer。測定所提取的DNA 濃度，低于2 ng/μL的DNA不能用于以下實驗。使用人類紅細胞RhD基因分型試劑盒，采用聚合酶鏈反應-序列特異性引物技術（PCR-SSP）進行PCR 擴增。PCR擴增條件：96℃預變性2 min ；然后96 ℃變性20 s，68 ℃退火1 min，循環5次；96 ℃變性20s，65 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，循環10次；96 ℃變性20 s，62 ℃退火50 s，72℃延伸45 s，循環18次；最后72 ℃延伸5 min，降溫至4 ℃完成擴增。2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物。

4 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件分析數據。采用Kendall's tau-b相關分析，比較RhD變異型與RhCcEe表型的相關性，計算相關系數，分析探討是否存在相關以及相關的方向。Kendall's tau-b相關系數取值范圍在[-1,+1]，負值代表負相關，正值代表正相關，0則代表不存在相關關系。以P＜0.05為顯著相關。

表1 RHD基因編碼區擴增和測序反應引物

3.3RHD基因外顯子測序及RHD雜合型分析：測定RHD基因的10個外顯子序列，擴增及測序引物設計參考文獻[1]，引物序列見表1。PCR反應體系為（20 μL）：DNA 1 μL、上下游引物（10 μM）各1 μL、高保真酶MIX 10 μL。擴增條件：95 ℃預變性10 min； 95 ℃變性40 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，循環40次；最后72 ℃延伸5 min，降溫至4 ℃完成擴增。引物合成和測序均由廣州艾基生物技術有限公司完成，將測序結果與參比序列Genebank BN000065進行比對。特異性擴增Rh融合盒子，判斷檢測樣本是否存在RHD基因的缺失，由天津秀鵬生物技術有限公司完成。

寄生蟲侵入宿主機體后首先表現IgM上升，IgM是一種大分子抗體，相對分子質量最大，故稱之為巨球蛋白，IgM能清除血流中的原蟲顆粒，為一種凝集性抗體，是直接、間接凝集實驗的診斷要素。張永紅等[12]在小鼠腹腔接種棘球蚴原頭節后，在未發育形成囊泡前30 d能測到低效價的IgM血清抗體，90 d后隨著囊泡不斷長大，IgM開始降低。本研究中HAE患者血清IgM抗體較正常對照組降低，考慮包蟲在宿主體內長期寄生，宿主的免疫抑制，導致IgM下降。

結 果

1992 年，RHD基因的cDNA被克隆[2]，隨后的十幾年里，從基因結構與功能方面探索RhD血型的研究進展迅速，特別是各地區人群RHD基因多態性的研究[3-7]為RHD等位基因的核苷酸序列提供了豐富的信息。根據國際輸血協會（ISBT）等位基因命名表，目前已確認的RhD變異型等位基因有3 0 0多種[8]，其中我國已發現有64種[9]。RHD*weak partial 15、RHD*DVI.3、RHD*DEL1是我國漢族人群中主要的RhD變異型等位基因[9]。RHD*weak partial 15約占RhD變異型的22.7%[10]，其變異位置在RHD基因第6外顯子、第9跨膜區（c.845G＞A，p.Gly282Asp），其突變可能影響了膜的整合，進而影響RhD蛋白和D抗原的合成表達。RHD*DVI.3是RHD基因第3～6外顯子被RHCE基因相應的部分替換形成的雜交基因（RHD-RHCE(3-6)-RHD），約占RhD變異型的.7%[10]。RHD*weak partial 15和RHD*DVI.3可通過間接抗人球蛋白法檢出。DEL型個體RhD抗原的表達明顯下降，血清學方法一般只能通過吸收放散實驗才能檢出。但吸收放散實驗操作繁瑣、耗時長，并不作為常規檢測方法，國內目前尚無明確診斷DEL型的標準，大部分實驗室常常將DEL型標記為RhD陰性。中國漢族人的RhD陰性率為0.34%[11]。綜合近年來相關文獻，DEL型在我國漢族RhD陰性個體的比率約為30%[11-13]。中國人群兩項具有大樣本的綜合性遺傳研究顯示[13-14]，95.4%（436/457）具有DEL表型的中國個體為RHD*DEL1。RHD*DEL1是RHD基因第9外顯子末位1處堿基同義突變（1227G＞A，K409K），導致RNA轉錄后在內含子剪切時，第9內含子的識別位點“左”移至第8內含子，由此將“第8內含子+第9外顯子+第9內含子”一起識別為一個“超大”內含子，“總是”被錯誤剪切，因此不能表達正常的RhD蛋白。隨著商業化抗體試劑效價和靈敏度的提高，一些抗原表達量較高的DEL型也可用間接抗人球蛋白法檢出弱陽性。本研究PCR-SSP法所采用的檢測試劑盒通過中國人群常見的RhD變異型設計，可初步篩查包括RHD*weak partial 15、RHD*DVI.3、RHD*DEL1在內的16種RhD變異型。RHD基因的兩端存在兩個具有98.6%同源性的區域，即Rh盒子序列。當RHD基因全缺失時，兩端Rh盒子融合為融合盒子。若樣本可檢出融合盒子，說明至少存在一條染色體RHD基因全缺失。本研究38例樣本中，1例RHD*weak partial 15/RHD*DEL1雜合型樣本未能檢測出Rh融合盒子，說明其不存在RHD基因全缺失。其余37例樣本均可檢出Rh融合盒子，可推測其一條染色體存在RhD變異型基因，另一條染色體為RHD基因全缺失。

2 PCR擴增及RHD基因檢測（PCR-SSP法） 利用PCR-SSP方法分析RHD基因編碼區，3 8例樣本中15例為RHD*weak partial 15（15/38，39.5%）；1 1例為R H D*D E L 1（1 1/3 8，2 8.9%）；5例為RHD*DVI.3（5/38,13.2%）；1例為RHD*weak D type 61（1/38，2.6%）；1例為RHD*weak partial 15/ RHD*DEL1雜合（1/38，2.6%）；5例采用PCRSSP法未能確認RhD變異型（5/38,13.2%）（圖1，表2）。

目前，慈王村發展散養珍珠草雞產業的主要威脅：在冬天，茶園、農家樂處于淡季，散養雞的銷售量也有所下降，這種依賴于其他產業發展的銷售模式存在被動性，擴展銷路刻不容緩。

圖1 RHD基因檢測（PCR-SSP法）結果

3 RhD變異型與RhCcEe表型相關性分析 38個樣本中PCR-SSP法共確認4種RhD變異型，其RhCcEe血型清學表型分別為RHD*weak partial 15：ccEe（1 3/1 5）、c c E E（1/1 5）、C c E e（1/1 5）；R H D*D E L 1：C C e e（8/1 1）、C c e e（3/8）；R H D*D V I.3：C c e e（4/5）、C c E e（1/5）；RHD*weak partial 15 / RHD*DEL1雜合：CcEe（1/1）；RHD*weak D type 6 1：CcEe（1/1）（表2）。經統計學處理，RHD*weak partial 15與RhCcEe抗原相關系數分別為：-0.685（P＜0.01）、0.440（P＜0.01）、0.727（P＜0.01）、-0.193（P＞0.05）；RHD*DEL1與RhCcEe抗原相關系數分別為：0.645（P＜0.01）、-0.760（P＜0.01）、-0.682（P＜0.01）、0.112（P＞0.05）；RHD*DVI.3與R h C c E e抗原相關系數分別為：0.3 6 9（P＜0.05）、0.201（P＞0.05）、-0.299（P＞0.05）、0.064（P＞0.05）。RHD*weak D type 61為個例，不參與統計分析（圖2）。

圖2 RhD變異型與RhCcEe表型相關性熱圖

3.1 RhD陰性確認及RhCcEe抗原檢測：使用3種不同生產廠家的抗-D定型試劑，根據抗體性質采用直接試管法或微柱凝膠卡間接抗人球蛋白法檢測RhD抗原。部分樣本加做熱吸收放散試驗。直接試管法檢測RhCcEe抗原。

圖3 RHD基因外顯子測序結果

圖4 RHD雜合型檢測結果

討 論

1 血清學檢測結果 8 5 8 6 2名首次獻血者中抗-D（IgM）抗體試劑直接試管法檢測陰性樣本609例，其中38例樣本抗-D（IgG）抗體試劑微柱凝膠卡間接抗人球蛋白法檢測結果為陽性或弱陽性。可疑樣本加做熱吸收放散試驗，結果均為強陽性。3 8例樣本中RhCcEe表型結果為：ccEe（17/38）、Ccee（8/38）、CCee（8/38）、CcEe（4/38）、ccEE（1/38）。

深圳是一座“移民”城市，人口來自全國各地，本研究結果顯示深圳地區血清學弱D表型獻血者的RHD基因結構呈現多態性，主要為RHD*weak partial 1 5（3 9.5%）、RHD*DEL 1（2 8.9%）、RHD*DVI.3（1 3.2%），基本符合中國人群分布特征。本研究進一步證實中國人群RhD變異型的分子背景非常復雜。除了以上3種我國漢族人群主要的RhD變異型等位基因，本研究還發現RHD*weakD type 61、RHD*weak D type 95、RHD* DCC、RHD* DFR1、RHD*weak D type 50以及尚未被ISBT數據庫收錄的RHD*IVS9-1C（c.1228-1G＞C）等位基因各1例。上海、廣州等地[10,15-16]曾有RHD*weak D type 61、RHD*weak D type 95、RHD* DCC、R H D* D F R 1的研究，均為個例報道。2 0 0 6年，Doescher等在GenBank提交RHD*weak D type 50等位基因序列數據（AM234631.1），之后各地再無相關報道。本研究的發現為后續進行該等位基因進一步的深入研究提供樣本基礎。本研究發現的1例新等位基因RHD*IVS9-1C（c.1228-1G＞C）與已知的RHD*01N.77（c.1228-1G＞A）等位基因的突變位置一致，但核苷酸取代不同[17]。RHD*01N.77被ISBT分類為RhD陰性，而本研究結果顯示新等位基因樣本與試劑3（上海血液生物公司抗-D單克隆IgG抗體）在微柱凝膠卡間接抗人球蛋白法中呈弱陽性反應，且熱吸收放散試驗結果呈強陽性。該位點核苷酸突變導致RhD變異型的發生機制有待我們后續進一步深入研究。

Rh血型抗原由位于1號染色體短臂1p34.3-1p36.1上2個緊密連鎖高度同源的RHD基因和RHCE基因編碼，其基因序列同源性高達93.8%，長度分別為57 295 bp和57 831 bp，均含有10個外顯子、9個內含子。RHD基因和RHCE基因各編碼417個氨基酸，2個基因緊密連鎖串聯排列，方向相反，3'端面對面相隔約30 000 bp[2]。RHD基因編碼RhD多肽，RHCE基因編碼RhCcEe多肽。1998年，WAGNER FF等研究發現DVI 3型為CDe單倍體，主要表現為Ccee表型[18]。隨著研究的深入，研究人員發現78%的弱D 15型個體表現為ccEe表型[19]。DEL表型也與C抗原陽性表型具有高度相關性。一項為期6年的研究表明，在歐洲獻血人群中紅細胞表達C抗原的個體為DEL表型的情況明顯高于其他RhD陰性人群[7]。超過83%的“亞洲型”DEL表現為Ccee表型[20]，其機制為RHCE基因中的C和/或E等位基因與RHD基因順式串聯從而進一步抑制了D蛋白的表達。本研究通過相關性分析，結果顯示RHD*weak partial 15與RhE抗原（相關系數為0.727，P＜0.01）、RHD*DEL1與RhC抗原（相關系數為0.645，P＜0.01）存在顯著正相關。本研究中RHD*DVI.3樣本數量較少，其統計分析結果需進一步加大數據量予以確認。

熱量傳遞可描述為能量由高溫體傳遞至低溫體的過程。與電學的歐姆定理相似，由傅里葉導熱定律，傳導的熱量可用溫度的比例關系定量描述為[7]

綜上所述，本研究所獲得的血清學弱D表型獻血者的RHD基因結構頻率可以粗略反映其在中國人群中的分布。由于RHD*weak partial 15與RhE抗原、RHD*DEL1與RhC抗原的相關性，RhC抗原和RhE抗原的血清學檢測可以有效篩選我國主要的RhD變異型，為后續進一步研究提供理論基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突