艾地苯醌對血小板生物學特性影響的初步研究*

林俊填 麥志周 楊富燕 伍偉健 劉運芝 余玉婷

艾地苯醌是一種輔酶Q10的類似物，能激活線粒體電子鏈系統，促進ATP的生成，改善腦缺血、缺氧時的能量代謝，而且還具有抗氧化作用，可消除腦缺血、缺氧時產生的大量自由基，從而阻止自由基對線粒體膜的脂質過氧化，保護線粒體膜維持其正常的生理機能[1-3]。因此，其主要用于治療慢性腦血管病及腦外傷等所引起的腦功能損害。另外，艾地苯醌還具有抗動脈粥樣硬化的作用[4]，是腦能量代謝的一種改善劑[5]。血小板胞漿內有豐富的線粒體，其主要功能是進行生物氧化，產生ATP供血小板活動所需。雖然臨床上進行血小板輸注越來越常見，但血小板體外保存時間短一直是臨床輸血領域公認的難題。本文主要研究艾地苯醌對血小板生物學特性的影響，探討其在血小板保存方面是否有潛在的應用價值。

材料與方法

1 實驗儀器 血小板聚集儀（北京STEELEX公司）、流式細胞儀（美國BD公司）、全自動血液分析儀（日本SYSMEX公司）、血小板保存箱（美國Helmer公司）、高速冷凍離心機（日本HITACHI公司）、Milli-Q 超純水裝置（美國Millipore公司）、-80 ℃低溫冰箱（日本三洋公司）。

2 主要試劑與藥品 血小板粘附管（江蘇金壇試劑站）、ADP（美國sigma公司），GSH（批號：20200916，南京建成生物工程研究所）、MDA試劑盒（批號：20201018，南京建成生物工程研究所）和JC-1檢測試劑盒（批號：20200824，南京建成生物工程研究所）；CD62p-FITC（批號：348936，美國BD公司）；CD61-PE（批號：346035，美國BD公司）、小鼠IgG1-FITC（批號：719522，美國BD公司）、小鼠IgG1-PE（批號：742633，美國BD公司）。

3 標本來源 本站單采的富血小板血漿標本6例。

4 方法

4.1 貧/富血小板血漿的制備：取本站單采血小板6例標本進行實驗。為避免單采血小板可能殘留的紅細胞（RBC）的干擾，我們先將單采血小板混勻后置于50 mL一次性無菌離心管中，以1 000 r/min離心10 min，小心取上清置于新離心管中，此上清液即為富血小板血漿（platelet rich plasma, PRP）。將上述富血小板血漿吸于中號培養皿中，置于血小板培養箱中恒溫振蕩保存。剩余的血漿繼續以3 000 r/min離心15 min后用相同的方法取出上清液，即可得貧血小板血漿（platelet poor plasma, PPP），備用。用自動血液計數儀檢測PRP中含有的血小板數目，檢測三次取平均值，用血細胞保養液ACD-A（亦可用pH 7.4 PBS緩沖液）調整血小板計數濃度為200×109/L。為方便后述實驗，我們根據實驗需要分別取3 mL PRP置于干凈培養皿中，并加入終濃度為10 μg/mL艾地苯醌濃縮液（DMSO配制）作為實驗組，另一培養皿中取3 mL PRP加入艾地苯醌濃縮液等量的空白DMSO作為實驗對照組[6]。將上述培養皿置于血小板專用保存箱中恒溫振蕩保存6 h。

4.2 血小板粘附率的檢測：采用血小板粘附管（玻珠柱）法進行測定，將粘附管與注射針進行連接，并從培養皿中直接吸取PRP，當PRP接觸玻璃珠時，開始計時，掌握好血液通過玻珠柱的速度，使血漿通過四等分的玻珠時，每段時間為5 s，共計20 s。分別采集玻珠柱前后端的PRP，進行手工法血小板計數，計算血小板粘附率，每例標本重復3次，取平均值。

4.3 血小板聚集率的檢測：PPP管采用與PRP管相同稀釋方法進行稀釋，以稀釋后PPP管作為血小板聚集實驗的空白對照。應用四通道血小板聚集儀檢測血小板的聚集率，在檢測前打開儀器預熱至37 ℃，比色皿內加入轉子、稀釋后的PRP或PPP溶液，將比色皿放到血小板聚集儀通道中預熱5 min后進行測量，分別加入1.0 mmol/L的ADP，檢測血小板的最大聚集率，每例標本重復3次，取平均值。

4.4 艾地苯醌處理前后MDA、GSH的對比：分別吸取相應劑量的PRP，嚴格按相關試劑的說明書進行操作與檢測（比色法），每例標本設3個平行管，取平均值。

4.5 流式細胞儀的檢測

4.5.1 血小板膜表面CD62p的變化：按照文獻[7]分析血小板CD62p的檢測方法進行血小板陽性率的測定。在對照管和試驗管中各加入血小板懸液5 μL，再分別加入10 μL小鼠免疫球蛋白IgGl-FITC抗體、10 μL小鼠IgGl-PE抗體、10 μL CD62p-FITC抗體和10 μL CD61-PE抗體，使血液標本與各種試劑輕輕混勻后，放在實驗室陰暗處、避光保存15～20 min左右。加入磷酸鹽緩沖液0.5 mL,準備上機檢測。使用光源488 nm的氬激光，流式細胞術獲取并分析3×104個血小板，通過前向角散射光FSC、側向角散射光SSC和CD61-PE染色的對數圖設門識別血小板群，然后分析門內血小板CD62p的陽性率。每例標本重復測定3次，取平均值。

4.5.2 膜電位JC-1的檢測：嚴格按試劑盒說明進行操作，取 200 μL JC-1工作液，加入5 μL濃縮血小板，混勻后置于暗室中孵育30 min，加入1%多聚甲醛800 μL，于4 ℃避光繼續孵育30 min，混勻后上流式細胞儀進行檢測。取5 μL濃縮血小板加入50 μL PBS作為空白對照。同樣捕獲3×104個血小板作參數分析，以陽性百分比（%）表示結果。每例標本重復測定3次，取平均值。

5 統計學處理 本研究應用 Graphpad Prism 7.0軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差(±s)表示，兩組組別間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 血小板粘附試驗 結果顯示，與對照組相比，經10 μg/mL艾地苯醌作用6 h后的實驗組，血小板粘附率有一定的下降，詳見表1。

2 血小板聚集試驗（ADP誘導法） 經10 μg/mL艾地苯醌作用6 h后的實驗組，與對照組相比，血小板聚集能力亦有一定程度的下降，詳見表格1。

3 MDA和GSH檢測結果 結果顯示，經10 μg/mL艾地苯醌作用6 h后，實驗組的MDA和GSH水平與對照組之間均有顯著性的差異，詳見表1。

4 流式細胞檢測結果 結果顯示10 μg/mL艾地苯醌作用后，血小板膜上的CD62p表達與對照組間無顯著性統計學差異；而實驗組JC-1較對照組有一定程度的增加，且兩者間有顯著性統計學意義，詳見表1，圖1。

圖1 流式細胞儀檢查血小板CD62p和JC-1指標變化

表1 艾地苯醌作用前后血小板相關指標的變化表

討 論

紅細胞采集后使用不同的保養液保存，可使體外保存時間得到明顯延長，如ACD保存液體可保存紅細胞21天，而使用MAP和SAGM紅細胞添加液可使紅細胞保存時間延長至35天，使用AS-1或AS-3可延長至42天[8]。反觀血小板的體外保存情況，多種因素都可能引起離體血小板失去活性。采用血小板專用保存袋，使用正確的保存溫度與振蕩條件，單采血小板在體外室溫下也最多可保存5天。因此，如何延長血小板的體外室溫保存時間也一直是困擾臨床輸血領域的難題。

CD62p又稱GMP140、P-選擇素，是選擇素超家庭的成員之一，是一種血小板膜蛋白，選擇性分布于靜止血小板或巨核細胞內的α顆粒中，血小板活化時，α顆粒迅速與血小板膜整合并釋放CD62p，使之出現于血小板表面，因此，CD62p的表達是血小板活化的一個特征指標[9]。

線粒體膜電位是指線粒體內膜兩側離子濃度不同所產生的跨膜電位差，是ATP合成和釋放的動力，是評價線粒體功能的敏感指標[10]。JC-1是一種碳氰化合物類陽離子熒光染料，可跨膜進入活細胞內定位于線粒體膜上，其聚集程度隨線粒體膜電位升高而增加。單體在激發光為527 nm時，呈綠色熒光；聚集體在激發光為590 nm時，呈紅色熒光。JC-1特異性地與線粒體內膜結合，只在線粒體膜電位崩解時才釋放出來[11]。

脂質氧化終產物丙二醛MDA在體外影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體內關鍵酶活性，它的產生還能加劇膜的損傷，因而測試MDA的量可反映機體脂質過氧化的程度，間接反應出細胞損傷的程度。谷胱甘肽GSH作為體內一種重要的抗氧化劑，能夠清除人體內的自由基[12]；由于GSH本身易受某些物質氧化，所以它在體內能夠保護許多蛋白質和酶等分子中的巰基不被有害物質氧化，從而保證蛋白質和酶等分子生理功能的正常發揮[13]。因此，測定體液或細胞內GSH和MDA水平是常用的反映氧化應激水平的重要指標。

文獻報道[6]艾地苯醌可以明顯的保護骨髓間質干細胞，促進細胞增殖并減少細胞凋亡。受此啟發，本研究主要是通過艾地苯醌減少血小板胞內的氧化應激從而達到延長血小板壽命的目的。研究結果顯示，應用10 μg/mL艾地苯醌作用后，實驗組較對照組GSH水平有一定的增加，而MDA水平有一定程度的下降，此結果說明細胞胞內的抗氧化水平提高。另外，結果還顯示胞內的JC-1水平提高，說明血小板的線粒體活性得到增強。以上結果說明艾地苯醌應該對血小板的壽命有一定保護作用。結果還顯示，艾地苯醌實驗組與對照組相比，血小板的粘附率和最大聚集率均有一定程度的下降，說明艾地苯醌可能會影響到血小板的粘附與聚集功能。流式細胞檢測CD62p結果顯示實驗組較對照組無顯著性差異，則說明血小板沒有脫顆粒與活化，這幾個結果說明艾地苯醌可能對血小板的粘附、聚集和脫顆粒功能產生抑制作用。有文獻報道[14]艾地苯醌可以抑制血小板聚集，其機制是可能影響TXB2的生成，與本文的結果基本一致。以上結果亦可間接說明，目前艾地苯醌主要用于缺血性腦損傷的治療，一方面有利于幫助腦部神經細胞功能的恢復，另一方面則對防止腦血栓的形成有一定幫助。

綜上所述，本研究結果提示10 μg/mL艾地苯醌可影響血小板內的線粒體功能，改善血小板內的氧化應激狀態，從而有利于血小板的保存。但是，本研究結果也初步證實艾地苯醌對血小板的粘附、聚集和顆粒釋放等生物學功能有一定的影響，這對于血小板保存和臨床應用方面又是一種不利的影響。因此，艾地苯醌在血小板的保存中能否應用，還需要進一步的實驗研究與探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突