藏、漢族EPAS1基因啟動子區DNA甲基化的差異研究*

李小薇 肖軍 雷慧芬 白曉瑩 孟方園 李翠瑩

我國高原面積約占國土面積1/4，因低壓低氧、干燥寒冷等不僅限制其發展，而且嚴重威脅進入高原環境工作及旅游等人員的身心健康。世居平原人員首次進入高原后會發生紅細胞（RBC）數目、血紅蛋白（Hb）濃度增加等生理改變，以改善組織供氧。但是進入高原若產生過多的紅細胞則使血液粘度加大，進一步加重組織缺氧，不利于高原習服。近年來，多項研究發現EPAS1、EGLN1等低氧誘導因子相關基因的序列變異在高原低氧適應中具有重要作用，且與藏族人相對低Hb濃度密切相關[1，2]。然而關于EPAS1基因DNA甲基化、組蛋白乙酰化等表觀遺傳學變化在高原低氧習服與適應中的研究較少。因此本研究擬在世居高原藏族、平原漢族及久居高原漢族中比較EPAS1基因DNA甲基化水平的差異，并分析其在高原低氧習服與適應的可能作用。

材料與方法

1 樣本來源 抽取世居高原藏族、世居平原漢族及久居高原漢族（＞10年）各10名志愿者抗凝血標本，志愿者全部為19～50周歲健康男性，平原漢族組19～44周歲（平均年齡2 7.8 0±8.0 8），久居高原漢族組24～50周歲（平均年齡33.30±8.11），世居高原藏族21～50周歲（平均年齡31.10±7.84）。所有志愿者均簽署知情同意書，并通過調查，排除相互之間的親緣關系。本研究經中國人民解放軍空軍特色醫學中心（原空軍總醫院）倫理委員會批準（第2017-08-YJ02）。

2 試劑和儀器

2.1 試劑：D N A提取試劑盒（Bio TeKe Corpration），DNA染料（BioTeKe Corpration），瓊脂糖（BIOWEST，REGΜLAR （AGAROSE，G-10）），NaHSO3（Zymo），EpiTYPER?Reagent Kit（Agena，Inc），總RNA提取試劑盒（天根生化，北京），Quant cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生化，北京），SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）（天根生化，北京）。

2.2 儀器：低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），核酸自動提取儀（Bio TeKe Corpration），分光光度計（Nano Drop 2000，Thermo），凝膠電泳成像儀（Major science），ABI veriti-384 PCR儀（ABI），384-well SpectroCHIP?bioarray芯片（Agena，Inc），Mass ARRAY Nanodispenser 點樣機（Agena，Inc），MassARRAY Analyzer 4.0質譜儀（Agena， Inc），普通PCR儀（伯樂T 1 0 0），實時熒光定量PCR儀（Thermo Fisher）。

3 實驗方法

3.1 DNA提?。翰捎肈NA提取試劑盒，取適量抗凝外周血，參照操作說明書提取基因組DNA。通過OD檢測及凝膠電泳檢測DNA濃度及純度；DNA總量：3～5 μg，濃度大于50 ng/μL。

3.2 甲基化引物設計與合成：通過美國國家生物信息中心（NCBI）獲取EPAS1基因序列（序列號NC_000002），按甲基化常規設計方法，截取基因轉錄起始位點的上游5 000 bp至下游1 000 bp序列，并預測CpG島，針對CpG島區進行方案設計。確定目的序列輸入到EpiDesigner軟件進行引物設計。根據軟件運行結果，選擇并確定合適的引物序列，合成帶有T7 RNA聚合酶啟動子序列的引物，5'端引物序列-aggaagagagGGGAATTAGATTGATTTTTTTAATTTT G，3'端引物序列-cagtaatacgactcactatagggagaaggctA ACCTCTACCCTAACCCTAACCC。擴增片段大小為600 bp，設計引物位置距離轉錄起始點-783 bp～-183 bp。

3.3 NaHSO3處理待檢測DNA樣品：使用3.6M亞硫酸鹽，作用DNA模板1.5 h，將樣本DNA中沒有甲基化的C全部轉化為U（相當于DNA中的T）。使用3.2設計的一對帶有T7啟動子序列的特殊引物擴增樣本，得到帶有T7 RNA聚合酶啟動子序列的600 bp擴增產物。

3.4 Agena MassArray系統進行甲基化檢測：在體外轉錄體系中，利用T7 RNA聚合酶，將擴增產物轉錄為RNA片段。在上步操作體系中，利用RNase A能夠特異性識別并切割RNA中U 3'端的特性，將RNA片段切割成攜帶有CpG位點的小片段。使用Agena MassArray?飛行質譜分析系統檢測產物，檢測結果使用MassArray EpiTYPER? 1.3軟件（Agena，Inc）獲取原始數據和圓點圖，根據含G峰和含A峰的面積比較，計算出待檢樣本甲基化及非甲基化程度，屬于兩者相對定量比值。檢測步驟包括PCR擴增反應，SAP反應，T切/RNase A 消化反應，樹脂純化，芯片點樣，Massarray分析及數據輸出。

3.5 總RNA提取及cDNA合成：采用血液總RNA提取試劑盒，取適量抗凝外周血，參照操作說明書提取總RNA。同時，采用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒進行cDNA合成，所得產物保存在-20℃冰箱。

3.6EPAS1基因mRNA表達引物設計、合成及qRTPCR擴增：通過美國國家生物信息中心（NCBI）獲取EPAS1基因RNA序列（序列號NC_000002），Primer Premier 5引物設計軟件設計EPAS1基因mRNA表達引物，F-5'ACGCCACCCAGTACCAGGA-3'，R-5'AATGAGGGCCCGAGCAGC-3'。采用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒參照試劑說明書檢測不同分組中EPAS1基因mRNA表達量。

4 統計學處理 采用SPSS 16.0進行不同分組人群中EPAS1基因啟動子區DNA甲基化程度的差異分析，符合正態分布進行獨立樣本t檢驗，不符合正態分布采用非參數Mann-Whitney U檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

本項目選擇E P A S 1基因轉錄起始位點G上游783 bp～183 bp啟動子區域，包含59個CpG位點的甲基化區域，檢測結果包含37個CpG位點甲基化程度。運用Agena MassArray核酸質譜定量檢測平原漢族、久居高原漢族及高原藏族3組DNA甲基化程度的差異，選擇甲基化程度＞2.5%的10個位點分析發現平原漢族、久居高原漢族及高原藏族部分CpG位點甲基化程度存在顯著差異（表1）。EPAS1基因啟動子區整體DNA甲基化程度分別為平原漢族組8.87%±10.31%、久居高原組7.17%±10.12%及高原藏族組9.32%±13.07%，3組人群中均無統計學差異（P＞0.05，圖1）。

圖1 3組人群中EPAS1基因啟動子區DNA甲基化程度

表1 3組人群中EPAS1基因啟動子區甲基化程度的差異

關于表觀遺傳學中DNA甲基化的研究普遍認為，基因啟動子區DNA甲基化發揮基因表達抑制的作用。本研究分析發現，久居高原漢族EPAS1基因表達量顯著高于平原漢族，世居高原藏族略高于平原漢族（圖2）。

圖2 3組人群中EPAS1基因表達量的比較久居高原組vs平原漢族組，*P＜0.05

有研究發現CpG位點甲基化與特定基因序列突變相關[3]。因此，研究者在3組人群中分析了EPAS1基因rs13419896、rs1868092及rs4953354位點序列突變與DNA甲基化的關系，結果發現3個位點序列突變與DNA甲基化程度不存在統計學差異（P＞0.05，圖3）。

圖3 3組人群中EPAS1基因序列突變與啟動子區DNA甲基化的分析

討 論

隨著基因組學及表觀基因組學的不斷發展，人們對遺傳學的認識和研究越來越深入，關于人類發育及腫瘤等疾病的調控機制除了包括基因序列變異等遺傳學改變外，還包括DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳學的作用。據報道，DNA甲基化與低氧誘導因子（HIF）共同參與高原低氧轉錄調節[4]。有研究發現低氧反應元件（HRE）與HIF-1結合位點存在多個CpG島，若某些特殊CpG位點發生甲基化，則會抑制DNA與各類轉錄因子結合，提示HIF-1結合的HRE相關基因調控對DNA甲基化水平具有一定的敏感性[5]。近年已有多項研究發現，高原低氧誘導因子相關基因EPAS1、EGLN1等序列變異及mRNA表達與高原適應密切相關，但關于EPAS1基因啟動子區DNA甲基化與高原低氧適應的研究較少[1，2]。因此，本研究對比了世居平原漢族、久居高原漢族及世居高原藏族3組中EPAS1基因DNA甲基化水平的差異，并分析EPAS1基因DNA甲基化程度對高原低氧適應的作用。

本研究采用Agena MassArray核酸質譜定量分析3組人群中EPAS1基因啟動子區DNA甲基化差異，結果發現世居高原藏族、世居平原漢族及久居高原漢族中僅部分CpG位點甲基化程度存在統計學差異，啟動子區整體甲基化程度無統計學差異，久居高原漢族低于平原漢族，與已有研究一致。如國外一項研究發現生活在安第斯山脈的高海拔（4 388米）人群EPAS1基因DNA甲基化水平低于生活在低海拔（0米）地區的同種人群，且甲基化程度與移居高原的居住年限呈負相關，因此研究者提出DNA甲基化對于高海拔地區的適應過程發揮重要作用[6]。

DNA甲基化特征在不同種族人群中存在差異[7]。本研究發現高原藏族人群的甲基化程度高于其他2組漢族人群，這與國外的研究不一致，但主要原因是國外的研究是在同一人群不同海拔高度。本文中高原藏族與平原漢族屬于不同的人群，可能不同人群本身具有甲基化水平的差異，但是飲食、壓力及運動等環境因素的作用引起了不一致結果。正如在埃塞俄比亞適應高海拔地區的遺傳結構中發現，高原藏族特有的與高原適應相關基因序列變異在埃塞俄比亞高原適應中無明顯相關，同時在埃塞俄比亞高海拔與低海拔人群中未發現HIF相關基因的DNA甲基化差異[8]。

國內一項關于高原低氧適應DNA甲基化譜的研究發現，世居高原藏族與移居平原藏族之間存在4 2 1個差異甲基化基因，排名前5位的差異甲基化基因包括5-羥色胺受體5B（HTR 5BP）、肌球蛋白1 C（M Y O 1 C）、富含亮氨酸的重復序列3 4（LRRC34）、含有144個家族的卷曲螺旋結構域N末端樣（CCDC144NL）及核糖核酸酶H1假基因1（RNASEH1P1）等；移居高原漢族與平原漢族之間存在55個差異甲基化基因，排名前5的差異甲基化基因包括受體家族11亞家族H成員2（OR11H2）、HBS 1樣翻譯GTP酶（HBS 1L）、嗅覺受體家族4亞家族K成員15（OR4K15）及T細胞受體β常數2（TRBC2）。國內在高海拔及低海拔地區的藏族與漢族DNA甲基化譜的研究中未展示與低氧誘導因子相關基因的甲基化差異[9]。

國內外研究證實，世代生存在高海拔地區的人類在適應高原缺氧環境的過程中表觀遺傳因素發揮了一定作用，但機制仍不清楚[6，8-9]。多項研究發現，關于癌癥形成機制中表觀遺傳因素具有重要作用，比如缺氧誘導因子HIF與表觀遺傳機制共同作用，對癌細胞缺氧做出積極反應[10-12]；在結直腸癌的研究中發現，EPAS1基因是高甲基化的[13]。這些研究強調了DNA甲基化在介導細胞應對缺氧反應中發揮重要作用，這也支持人類可通過表觀遺傳機制適應高海拔缺氧環境的觀點。本研究發現，久居高原漢族EPAS1基因啟動子區DNA甲基化水平低于平原漢族，而mRNA表達量顯著高于平原漢族，意味著平原漢族進入高原后可能通過DNA甲基化的改變影響EPAS1基因mRNA表達來適應高原低氧環境；而藏族EPAS1基因DNA甲基化水平高于漢族，但mRNA表達量仍高于平原漢族，這與漢族中結果不一致，藏族世代居住高海拔地區，其適應高原的機理更復雜，DNA甲基化以何種機制參與其中，仍需進一步研究。

綜上所述，本研究發現久居高原漢族EPAS1基因DNA甲基化程度低于平原漢族，DNA甲基化程度低可促進EPAS1基因mRNA表達，結果表明漢族人群移居高原后可通過DNA甲基化的改變影響EPAS1基因表達以適應高原缺氧環境。高原藏族EPAS1基因DNA甲基化程度高于平原漢族及久居高原漢族，這與EPAS1基因mRNA表達水平不一致，可能跟不同人群及環境因素有關系，通過其他未知途徑參與高原適應。根據本研究發現，下一步可進行同一人群不同海拔高度全基因組DNA甲基化研究，這些基因和通路在高原缺氧適應過程中可能會發生DNA甲基化變化。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突