高原低氧快速適應人群篩選及其低氧適應相關基因的表達研究*

李翠瑩 李小薇 肖軍 雷慧芬 孟方園 高瞻

高原具有低壓缺氧（其氧濃度僅為海平面的60%）、寒冷干燥等不利因素，會引起急進高原的平原人員發生一系列生理或病理改變，主要表現在血紅蛋白代償性升高、血氧飽和度降低等，約75.7%的人群會出現輕中度高原反應，嚴重者可導致肺水腫、腦水腫等疾病[1-2]。有研究提出在高原條件下，藏、漢族人群創傷休克時因失血、缺氧等因素導致其輸血策略不同：急進高原人員輸血量是高原移居者的1.5倍，是高原藏族的2倍[3]。可見，高原條件的輸血策略具有與平原地區不同的特點。合理、有效的輸入血液成分及篩選高攜氧能力的紅細胞輸注是高原輸血治療的關鍵。

目前已知，血紅蛋白（hemoglobin，Hb）具有結合、貯存、運輸和釋放氧的能力，但其結構和功能的研究仍然是高原低氧醫學的重點。近年來多項研究發現，藏族基因突變頻率高于漢族，藏族血紅蛋白氧親和力高于漢族，動脈血氧飽和度接近平原地區，是長期自然選擇和進化的結果，存在遺傳學因素的作用[4]。遺傳基因與低氧適應密切相關，其中以低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）相關基因EPAS1、EGLN1和PPARA為主，其在遺傳水平影響著高原低氧環境的適應性[5]。那么漢族是否存在快速適應高原的優勢基因型人群？平原漢族進入高原后紅細胞（red blood cell，RBC）及血紅蛋白變化規律等問題還有待進一步研究。

本文針對平原漢族人群進入高原后低氧習服適應的變化規律及發生機制進行研究，在藏、漢族人群高原適應的差異研究基礎上，篩查高原低氧誘導因子相關基因及高氧親和力血紅蛋白F（HbF）分型的人群，選擇高表達低氧適應相關基因及其高攜氧能力的紅細胞，篩選高原低氧快速適應人群。

對象與方法

1 研究對象 采集平原漢族（海拔50～500米）、進駐高原（海拔2 500～3 000米、3 700～4 600米）3天、7天、30天、90天、久居高原（＞10年）漢族及世居高原藏族血液樣本742份，進行藏、漢族人群高原適應的差異研究。所有受試者均簽署知情同意書，并通過個人調查，排除相互之間的血緣關系。該項目通過倫理審批，審批號：空總（科研）第2017-16-YJ01。

2 研究方法

2.1 血常規及血氧飽和度檢測：根據世居平原漢族（海拔50～500米）、急進高原3天（海拔2 500～3 000米）和7天漢族（海拔3 700～4 600米）、高原低氧習服訓練30天漢族（海拔3 700米）、高原低氧習服訓練90天漢族（海拔3 700米）、世居高原藏族（海拔3 700米）及久居高原漢族（海拔3 700米居住＞10年）進行分組，采用全自動血細胞分析儀和血氧飽和度檢測儀測定不同分組血液樣本的血常規及血氧飽和度SpO2數據。

2.2EPAS1、EGLN1和PPARA基因mRNA表達水平檢測：對上述分組人群的血液樣本提取總RNA，并反轉錄為cDNA；設計3個基因的實時定量PCR引物，SYBR Green法檢測3個基因mRNA表達量，明確不同分組人群中高原低氧適應相關基因mRNA表達水平的差異。

2.3 高氧親和力HbF分析：根據上述分組，平原漢族、久居高原漢族及世居高原藏族中每組20例，采用蛋白電泳方法分析高氧親和力HbF差異，操作步驟參照試劑盒說明書。

3 統計學處理 采用SPSS 26.0進行不同分組人群血常規及SPO2的差異分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，符合正態分布進行獨立樣本t檢驗；多組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用Dunnett't分析；重復測量資料采用重復測量方差分析，多重比較采用Bonferroni方法進行校正；不符合正態分布采用非參數Mann-Whitney U檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 不同分組人群中生理指標的檢測結果 與平原漢族男性對比，急進高原3天、7天、高原習服訓練30天、90天及久居高原漢族血紅蛋白濃度顯著升高，世居高原藏族Hb濃度略有升高（表1、表2）；平原漢族進入高原后血氧飽和度（SpO2）顯著降低，世居高原藏族SpO2與平原漢族比較略有降低（圖1）。

2 其他血液指標變化 ①紅細胞與紅細胞壓積（Hct）：與平原漢族男性比較，進入高原后（3天、7天、30天、90天）、久居高原漢族及藏族均顯著升高；②白細胞（white blood cell，WBC）：平原漢族男性進入高原后升高，藏族及久居高原漢族男性高于平原漢族；③血小板（platelet，PLT）：平原漢族男性進入高原后升高，藏族男性明顯高于平原漢族和久居高原漢族（表1、表2）。

表2 同一組人員進入高原前后血常規各參數統計學分析（ ±s）

3 血液SpO2結果 與平原漢族SpO2（9 4～9 9%，97.28±1.46%）對比，急進高原3天SpO2（79～93%，8 7.6±3.1%）顯著降低，高原習服3 0天SpO2（85～95%，90.4±2.6%）有所升高，但仍低于平原漢族；久居高原組SpO2（80～95%，87.7±5.6%）與急進高原3天數據接近，藏族SpO2（89～100%，94.5±2.5%）仍低于平原，但高于其他分組（圖1）。

圖1 不同分組人群中血氧飽和度SpO2的差異

4 高原低氧適應相關基因EPAS1、EGLN1及PPARA的mRNA表達水平檢測結果 平原漢族進入高原3天及7天EPAS1基因表達升高，激活下游EPO等靶基因轉錄，增加機體血紅蛋白含量；EGLN1和PPARA基因急進高原3天時表達顯著降低，減少對EPAS1基因表達的抑制，促進其下游靶基因轉錄，高原習服訓練30天3個基因表達水平達到平衡；高原習服90天及久居高原漢族3個基因的表達水平均顯著高于世居平原漢族，世居高原藏族EPAS1及PPARAmRNA表達水平高于世居平原漢族，與其血紅蛋白含量高于平原漢族結果相一致（圖2）。同時，分析了平原漢族進入高原3天EPAS1基因表達升高與未升高人員的高原前后血常規參數變化情況，EPAS1基因表達未升高人員進入高原后RBC、Hb及Hct變化明顯高于升高人員（表3）。

圖2 不同分組人群中EPAS1、EGLN1及PPARA基因表達水平

表3 EPAS1基因表達明顯變化人員高原前后血常規各參數差值的統計學分析（ ±s）

5 不同分組人群中高氧親和力HbF分析 蛋白電泳檢測高氧親和力H b F差異：正常成人血紅蛋白HbA≥96.5%，HbF＜2.0%，HbA2≤3.5%，而嬰兒血紅蛋白HbF 60%～93%，HbA2＜1%，其中HbF具有更高的氧親和力。對不同分組人群中血紅蛋白進行電泳發現，世居高原藏族人群中54.5% HbF電泳陽性，久居高原漢族人群中27.3% HbF電泳陽性，平原漢族人群中僅有14.3% HbF電泳陽性（圖3）。

圖3 高原低氧環境下不同分組中血紅蛋白分型的差異

討 論

高原低氧環境下創傷失血性休克是高原醫學救治的難點，主要存在兩方面問題，一方面是救治困難、死亡率高，因高原低壓缺氧等特殊環境導致機體失血耐受能力低、液體耐受能力小、多器官衰竭發生早，救治效果差，死亡率顯著高于平原[2]；另一方面是高原輸血策略與平原地區不同，平原漢族急進高原失血性休克的輸血量是藏族的2倍，大量輸血導致血流減緩，加重組織缺氧，不利于救治[3]。因此，合理、有效的輸入高攜氧能力血液成分是高原輸血治療的關鍵。

近年來國際頂尖雜志Science、Nature、Cell等發表的多篇文章表明，關于藏漢族高原耐缺氧機制的研究多集中在低氧誘導因子相關基因以及紅細胞攜釋氧功能研究等[6-8]。通過本研究，明確了進入高原后紅細胞及血紅蛋白的變化規律。項目組研究發現高原低氧對機體血液參數產生較大影響，甚至影響機體免疫功能。平原漢族進入高原后機體通過增加RBC及Hb水平以滿足各個組織器官的氧供，而這種變化也增加了血液粘度，伴隨著PLT計數升高，可能增加血栓形成的風險；而且在高原低氧條件下，WBC亦升高，提示機體免疫功能也可能出現紊亂。針對前述問題，則需篩選快速適應高原的平原人群，并對其進行低氧習服訓練，以更快適應極端的低氧環境，而不出現嚴重的高原反應[9]。因此，本項目前期在平原漢族男性中篩選出EPAS1基因rs13419896和rs1868092位 點A-A優 勢 單 體 型，EGLN 1基 因rs 1 2 0 9 7 9 0 1和rs2790859位點G-C優勢單體型，攜帶上述高原優勢單體型的人群可快速習服適應高原[10-11]。

關于低氧誘導因子相關3個基因mRNA表達水平研究發現平原漢族急進高原后EPAS1基因表達水平顯著升高，EGLN1基因、PPARA基因表達具有相應的變化規律。分析原因：①EPAS1編碼低氧誘導因子HIF-2α，作為低氧誘導因子的主要成分之一，高原低氧環境刺激其表達升高是高原習服的表現，其可激活下游EPO等靶基因轉錄，增加RBC計數及Hb含量適應高原。因此我們認為進入高原后EPAS1基因表達量高于平原的人群利于機體紅細胞生成，使高原低氧機體紅細胞造血達到平衡，避免過多的紅細胞產生，可快速習服高原的適應人群。②EPAS1及PPARA負調控HIF-2α，平原進入高原3天表達下調，進而減少對HIF-2α表達的抑制，促進HIF下游EPO等靶基因的表達，促進紅細胞生成及成熟，利于高原習服適應。本研究分析發現平原漢族急進高原3天EPAS1基因表達未升高人員進入高原后RBC、Hb及Hct變化明顯高于基因表達升高人員，提示EPAS1基因表達未升高人員進入高原后可能存在血液粘度顯著升高，不利于高原低氧習服。因此，篩選進入高原3天EPAS1基因表達升高人員可利于平原漢族的高原低氧習服適應。

項目組通過蛋白電泳檢測發現，世居高原藏族高氧親和力血紅蛋白分型HbF含量最高，其次是久居高原漢族，平原漢族中最少。藏族人群血液中高氧親和力HbF含量高，說明其動脈血氧飽和度相對較高，這與藏族SPO2高于急進高原組和高原習服組結果一致（圖1）。而本研究中久居高原組HbF比例比平原漢族多，但是高原地區久居高原組SPO2卻低于高原習服組，分析原因可能是該組人員數量較少。這與項目組前期平原漢族、急進高原、高于習服、久居高原漢族及高原藏族人群的紅細胞攜釋氧功能P50[12-13]及拉曼光譜測定血紅蛋白結構的研究結果一致[14-15]。因此，世居平原漢族急進高原初期主要通過RBC計數、Hb含量增加及RBC釋放氧功能增加保證機體供氧；隨著進駐高原時間的延長，RBC與氧的親和力逐漸增加產生高原習服；世居高原藏族RBC計數及Hb含量略高于平原，其對高原適應主要源于紅細胞與氧的親和力強，滿足機體各個組織及器官供氧。

綜上所述，本研究對世居高原藏族、世居平原漢族、急進高原3天及7天、高原習服30天及90天、久居高原漢族人群分組，開展高原適應人群的篩選研究，篩選出進入高原EPAS1基因表達升高的人群，具有高攜氧能力紅細胞HbF的人群，為高原低氧適應人群的選拔提供依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突