長鏈非編碼RNA鉀離子電壓門控通道亞家族Q成員1重疊轉(zhuǎn)錄本1通過靶向miR-24-3p調(diào)控人牙周膜干細(xì)胞增殖和成骨分化

龐鳴韋紅霞陳茜

1.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院口腔科，柳州545005；

2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京康復(fù)醫(yī)院口腔科，北京100144

牙周組織又稱牙齒支持組織，包括牙槽骨、牙齦、牙周膜和牙骨質(zhì)，牙周組織的健康情況與牙齒的使用和壽命有關(guān)，其中，牙周膜是由包裹在牙根周圍富含血管系統(tǒng)和神經(jīng)的纖維組成的結(jié)締組織，負(fù)責(zé)牙周組織的支持、感知、營養(yǎng)、修復(fù)等功能。牙周炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見口腔疾病，它破壞牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能完整性。眾所周知，牙周治療的基本目的是控制牙周組織炎癥，并使局部被破壞的牙周組織再生[1]。人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）是來源于牙周膜的成體干細(xì)胞，被證明具有向骨、牙骨質(zhì)和牙周韌帶分化的優(yōu)異能力[2-4]。

研究[5-7]表明，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在干細(xì)胞自我更新和多向分化中發(fā)揮重要作用。鉀離子電壓門控通道亞家族Q成員1重疊轉(zhuǎn)錄本1（potassium voltage-gated channel subfamily Q member 1 overlapping transcript 1，KCNQ1OT1）位于人染色體11p上，是一個染色質(zhì)調(diào)控RNA[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)成骨培養(yǎng)基處理的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human marrow mesen‐chymal stem cells，hBMSCs）中，lncRNA KCNQ-1OT1表達上調(diào)，lncRNAKCNQ1OT1通過調(diào)節(jié)miR-320a/Smad5軸影響骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）表達以及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，從而促進hBMSCs的成骨分化。lncRNA KCNQ1OT1在hBMSCs成骨誘導(dǎo)中顯著上調(diào)，敲低lncRNAKCNQ1OT1通過上調(diào)miR-214來抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）以及成骨相關(guān)基因的表達，從而抑制hBMSCs的成骨分化[10]。然而lncRNA KCNQ1OT1在hPDLSCs成骨分化中的作用尚不清楚。本實驗通過StarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)lncRNA KCNQ1OT1與miR-24-3p具有結(jié)合位點。研究[11]報道，在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow mesenchymal stem cells，BM‐SCs）和胚胎成骨前體細(xì)胞（MC3T3-E1）的成骨分化過程中，miR-24表達下調(diào)，過表達miR-24降低ALP活性、基質(zhì)礦化和成骨分化標(biāo)志物的表達，而沉默Tcf-1明顯抑制了下調(diào)miR-24對成骨分化的促進作用。miR-24-3p在hPDLSCs成骨分化中下調(diào)，過表達miR-24-3p通過下調(diào)Smad5表達來抑制hPDLSCs的成骨分化[12]。盡管已有研究確定miR-24-3p在hPDLSCs成骨分化中的作用，但lncRNA KCNQ1OT1是否通過靶向調(diào)控mi R-24-3p表達來影響hPDLSCs的成骨分化目前還尚未可知。因此，本實驗旨在研究lncRNA KCNQ1OT1是否通過調(diào)控miR-24-3p表達來影響hPDLSCs的成骨分化。

1 材料和方法

1.1 材料

收集因正畸治療而需拔牙，且無牙周炎患者的牙周膜組織。所有受試者均無系統(tǒng)性疾病、正頜手術(shù)史等，且對本研究知情同意。牙齒拔出后立即置于無菌PBS中，刮取牙周膜組織，剪碎，加入1%Ⅰ型膠原酶，37℃消化1 h，之后加入含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)3 d后，于倒置顯微鏡下觀察到hPDLSCs呈簇密集排列，細(xì)胞呈長梭形。繼續(xù)培養(yǎng)1周后觀察到細(xì)胞從組織邊緣游出，即細(xì)胞分離培養(yǎng)成功。當(dāng)細(xì)胞融合至80%后采用胰蛋白酶消化，并進行傳代培養(yǎng)。

1.2 試劑

Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒（Takara公司，日本）；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司）；Lipofectamine2000（上海信帆生物科技有限公司）；si-NC、si-KCNQ1OT1、miRNC、miR-24-3p、anti-miR-NC、anti-miR-24-3p（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），pcDNA、pcDNA-KC‐NQ1OT1（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒（上海研謹(jǐn)生物科技有限公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。

1.3 成骨誘導(dǎo)

取第3代生長狀態(tài)良好的的hPDLSCs，與礦化液（10 mmol·L-1β-磷酸甘油鈉、50 mg·mL-1維生素C、100 nmol·L-1地塞米松）共培養(yǎng)誘導(dǎo)成骨分化，培養(yǎng)2周后獲得成骨分化細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

取誘導(dǎo)組hPDLSCs，實驗設(shè)置si-NC組（si-NC轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)組hPDLSCs）、si-KCNQ1OT1組（si-KCNQ1OT1轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)組hPDLSCs）、pcDNA組（pcDNA轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)組hPDLSCs）、pcDNAKCNQ1OT1組（pcDNA-KCNQ1OT1轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)組hPDLSCs）、miR-NC組（miR-NC轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)組hPDLSCs）、miR-24-3p組（miR-24-3p轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)組hPDLSCs）、si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組（si-KCNQ1OT1與anti-miR-NC共轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)組hP‐DLSCs）、si-KCNQ1OT1+anti-miR-24-3p組（siKCNQ1OT1與anti-miR-24-3p共轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)組hPDLSCs）。各組轉(zhuǎn)染均按照Lipofectamine2000試劑盒說明進行。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quanti‐tative polymerase chain reaction，RT-qPCR）

提取hPDLSCs和誘導(dǎo)組hPDLSCs的細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按試劑盒說明進行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），檢測各組lncRNA KCNQ1OT1和miR-24-3p水平以驗證轉(zhuǎn)染效果。同時檢測成骨基因OCN、OPN、ALP mRNA的表達水平。lncRNAKCNQ1OT1上游引物序列：5’-ACTCACTCACTCACTCACT-3’，下游引物序列：5’-CTGGCTCCTTCTATCACATT-3’；miR-24-3p上游引物序列：5’-GATCCTGGCT‐CAGTTCAGCAGGAACAGC-3’，下游引物序列：5’-TCGAGCTGTTCCTGCTGAACTGAGCCAG-3’；OCN上游引物序列：5’-TGAGAGCCCTCACACTCCTC-3’，下游引物序列：5’-CGCCTGGGTCTCTTCACTAC-3’；OPN上游引物序列：5’-GAAGTTTCGCAGACCTGACAT-3’，下游引物序列：5’-TGCACCATTCAACTCCTCG-3’；ALP上游引物序列：5’-ACACCTTGACTGTGGTTACTG-3’，下游引物序列：5’-CCATATAGGATGGCCGTGAAG-3’；磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列：5’-AG‐GTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，下游引物序列：5’-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’；U6上游引物序列：5’-GCTTCGGCAGC-ACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列：5’-CGCTTCACGAATTT‐GCGTGTCAT-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.6 細(xì)胞增殖

采用MTT法檢測各組的細(xì)胞增殖，以密度為每毫升2×105個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，培養(yǎng)24、48、72 h，待細(xì)胞貼壁后棄去上清液，每孔加入5 g·L-1MTT 20μL，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入二甲基亞砜150μL。振搖5 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處的光密度（optical density，OD）值，即代表細(xì)胞活性。每組3個重復(fù)。

1.7 蛋白印跡（Western blot）法檢測蛋白表達

提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒進行定量。各組蛋白上樣量60μg，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate poly‐acrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，用5%脫脂牛奶室溫封閉，然后加入一抗4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，加入二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，暗室中曝光顯影，定影，用Quantity One軟件檢測各組蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.8 雙熒光素酶報告實驗檢測lncRNAKCNQ1OT1和miR-24-3p的靶向關(guān)系

構(gòu)建KCNQ1OT1野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-KCNQ1OT1和MUT-KCNQ1OT1，將其分別與mi R-NC和miR-24-3p共轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)組hP‐DLSCs中，按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以xˉ±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA KCNQ1OT1和miR-24-3p在hPDLSCs成骨誘導(dǎo)中的表達

與對照組比較，經(jīng)成骨誘導(dǎo)的hPDLSCs中，lncRNA KCNQ1OT1的表達水平升高，miR-24-3p的表達水平降低（P＜0.05）（圖1）。

圖1 lncRNA KCNQ1OT1和miR-24-3p在hPDLSCs成骨誘導(dǎo)中的表達Fig 1 Expression of lncRNA KCNQ1OT1 and miR-24-3p in os‐teogenic induction of hPDLSCs

2.2 下調(diào)lncRNA KCNQ1OT1對hPDLSCs增殖、OCN、OPN和ALP的影響

與si-NC組比較，si-KCNQ1OT1組lncRNA KCNQ1OT1的表達水平降低（圖2A），細(xì)胞活性降低（圖2B）；OCN、OPN和ALP的mRNA與蛋白表達水平降低（圖2C、D、E）（P＜0.05）。

圖2 下調(diào)lncRNA KCNQ1OT1對hPDLSCs增殖、OCN、OPN和ALP的影響Fig 2 The effects of down-regulating lncRNAKCNQ1OT1 on the proliferation,OCN,OPN and ALP of hPDLSCs

2.3 lncRNA KCNQ1OT1靶向調(diào)控miR-24-3p的表達

StarBase預(yù)測顯示lncRNA KCNQ1OT1的序列中含有與miR-24-3p互補的核苷酸序列（圖3左）。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，在WT-KCNQ-1OT1中，與miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-24-3p組的雙熒光素酶活性降低，而在MUT-KCNQ1OT1中，miR-NC與miR-24-3p的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3中）。與pcDNA組比較，pcDNA-KC‐NQ1OT1組的miR-24-3p表達水平降低；與si-NC組比較，si-KCNQ1OT1組的miR-24-3p表達水平升高（P＜0.05）（圖3右）。

圖3 lncRNA KCNQ1OT1靶向調(diào)控miR-24-3p的表達Fig 3 lncRNA KCNQ1OT1 targets and regulates mi R-24-3p expression

2.4 過表達miR-24-3p對hPDLSCs增殖、OCN、OPN和ALP的影響

與mi R-NC組比較，miR-24-3p組miR-24-3p的表達水平升高（圖4A），細(xì)胞活性降低（圖4B）；OCN、OPN和ALP的mRNA與蛋白表達水平降低（圖4C、D、E）（P＜0.05）。

圖4 過表達miR-24-3p對hPDLSCs增殖、OCN、OPN和ALP的影響Fig 4 The effects of overexpression of miR-24-3p on the proliferation,OCN,OPN and ALP of hPDLSCs

2.5 抑制miR-24-3p表達可逆轉(zhuǎn)下調(diào)lncRNA KC‐NQ1OT1表達對hPDLSCs增殖、OCN、OPN和ALP的影響

與si-NC組比較，si-KCNQ1OT1組miR-24-3p的表達水平升高，細(xì)胞活性降低，OCN、OPN和ALP的mRNA與蛋白表達水平降低；與si-KC‐NQ1OT1+anti-miR-NC組比較，si-KCNQ1OT1+an‐ti-miR-24-3p組miR-24-3p的表達水平降低，細(xì)胞活性升高，OCN、OPN和ALP的mRNA與蛋白表達水平升高（P＜0.05）（圖5）。

圖5 抑制mi R-24-3p表達可逆轉(zhuǎn)下調(diào)lncRNAKCNQ1OT1表達對hPDLSCs增殖、OCN、OPN和ALP的影響Fig 5 The effects of overexpression of miR-24-3p on the proliferation,OCN,OPN and ALP of hPDLSCs

3 討論

牙周炎是一種慢性炎性疾病，是成年人牙齒脫落的主要原因，目前還沒有有效的治療方法[13]。hPDLSCs可分化為成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞，在牙周組織的維持和再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。利用hPDLSCs治療牙周炎是近年來的研究熱點之一，hPDLSCs可能是理想的種子細(xì)胞[15-16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)，lncRNA在多種復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展過程中特異性表達，且在干細(xì)胞的干性維持及多向分化中也發(fā)揮著重要作用。如與未經(jīng)成骨誘導(dǎo)的PDLSCs相比，成骨誘導(dǎo)的PDLSCs中l(wèi)ncRNA-DANCR表達下調(diào)，成骨相關(guān)標(biāo)記物ALP、Runx2、OCN和BMP-2表達上調(diào)，而上調(diào)lncRNA DANCR則抑制了PDLSCs的成骨分化潛能[18]。在hPDLSCs成骨分化過程中，lncRNA TUG1表達上調(diào)，miR-222-3p表達下調(diào)。LncRNA-TUG1通過miR-222-3p/Smad2/7促進hPDLSCs成骨分化[19]。lncRNA KC‐NQ1OT1在小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（mouse mesenchy‐mal stem cells，mMSCs）成骨誘導(dǎo)過程中高表達，可顯著上調(diào)Runx2、Osterix和OCN mRNA水平，增強ALP活性，通過激活Wnt/catenin通路促進成骨分化[20]。在肌腱干細(xì)胞（tendon stem cells，TSCs）成脂和成骨分化中，lncRNA KCNQ1OT1表達上調(diào)，miR-138表達下調(diào)，敲減lncRNA KCNQ1OT1通過上調(diào)miR-138來抑制TSCs的成脂和成骨分化[21]。越來越多證據(jù)[22-23]表明，成骨分化是一個復(fù)雜的生理過程，涉及OCN、OPN和ALP、Ruxn2和Osterix等調(diào)節(jié)因子。OCN、OPN、ALP是比較可靠的成骨分化標(biāo)志物，其水平高低可反映成骨分化能力的大小[24-25]。

本實驗結(jié)果顯示，在hPDLSCs成骨誘導(dǎo)中，lncRNA KCNQ1OT1表達上調(diào)，下調(diào)lncRNA KC‐NQ1OT1抑制細(xì)胞增殖以及成骨標(biāo)志物OCN、OPN和ALP的表達，提示下調(diào)lncRNA KCNQ1-OT1抑制hPDLSCs的增殖和成骨分化。研究[9-10]表明，lncRNA KCNQ1OT1可作為競爭性內(nèi)源RNA負(fù)調(diào)控mi RNA表達促進成骨分化。本實驗的Star‐Base預(yù)測顯示lncRNA KCNQ1OT1的序列中含有與miR-24-3p互補的核苷酸序列，雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，在WT-KCNQ1OT1中，mi R-24-3p組的雙熒光素酶活性顯著降低，且過表達lncRNA KCNQ1OT1（pcDNA-KCNQ1OT1）和下調(diào)lncRNA KCNQ1OT1（si-KCNQ1OT1）均顯著降低和升高miR-24-3p的表達，即證實了lncRNA KCNQ1OT1靶向調(diào)控miR-24-3p這一相互作用。在hPDLSCs成骨誘導(dǎo)中，miR-24-3p表達下調(diào)，過表達miR-24-3p也降低了細(xì)胞增殖以及成骨標(biāo)志物OCN、OPN和ALP的表達，提示過表達miR-24-3p抑制hPDLSCs的增殖和成骨分化。且抑制miR-24-3p表達可逆轉(zhuǎn)下調(diào)lncRNA KCNQ1OT1表達對hP‐DLSCs增殖、OCN、OPN和ALP的影響，提示ln‐cRNA KCNQ1OT1可能通過調(diào)控miR-24-3p影響hPDLSCs的增殖和成骨分化。

綜上所述，下調(diào)lncRNA KCNQ1OT1通過靶向上調(diào)miR-24-3p抑制hPDLSCs的增殖和成骨分化。lncRNAKCNQ1OT1可能成為治療牙周炎的新靶點，然而這僅限于體外實驗，lncRNA KC‐NQ1OT1在體內(nèi)的作用以及調(diào)控機制還需要進一步研究和驗證。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。