過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α在牙周炎誘發大鼠肝損傷中的作用研究

夏博園李艷丁旭李鑫劉歆嬋于維先，3

1.吉林大學口腔醫院牙周病科，長春130021；

2.吉林大學口腔醫院老年口腔科，長春130021；

3.吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室，長春130021

牙周炎是牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）感染為主，以牙周結締組織破壞和牙槽骨吸收為特點的慢性炎癥性疾病，是全身系統疾病的危險因素之一[1]。越來越多的證據[2-3]表明，牙周炎與肝損傷如非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD），肝硬化及肝癌等疾病密切相關，但具體機制尚未明確。

近年來研究[4]表明，牙周炎患者的牙周組織、血清、齦溝液及唾液中氧化應激標志物顯著升高，抗氧化物水平明顯下調，提示氧化應激損傷在牙周軟硬組織破壞中發揮了重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α）是一種共激活轉錄因子，其與下游的關鍵抗氧化蛋白核因子E2-相關因子2（nuclear factor ery‐throid 2-related factor 2，Nrf2）及線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）可增加細胞內線粒體生物合成能力和降低細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平維持體內抗氧化-氧化系統平衡[5-7]，進而緩解肝組織損傷[8]。研究[9]發現，牙周炎大鼠牙齦組織中氧化應激水平升高，同時伴有P gc-1α、Nrf2和Tf am的基因表達水平顯著下調，因此本研究通過體內實驗初步探究PGC-1α及其下游蛋白在牙周炎誘發肝損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和設備

8周齡清潔級Wistar雄性大鼠（購于吉林大學實驗動物中心）；P.gingivalis標準菌株ATCC33277（首都醫科大學贈送）；正畸結扎絲（直徑0.2 mm）；卡那霉素、水合氯醛（上海源葉生物科技有限公司）；羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cel‐lulose，CMC-Na）、3,3-二氨基苯聯胺（diamino‐benzidine，DAB）顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Trizol試劑（Ambition公司，美國）；逆轉錄試劑盒、SYBR Prime-ScriptTM實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（TaKaRa公司，日本），引物由TaKaRa公司設計合成；PGC-1α抗體（Abcam公司，美國）；兔鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶（streptavidin-pe‐rosidase，SP）試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantita‐tive real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（Thermo公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠牙周炎模型 24只雄性Wistar大鼠（200～220 g）隨機分為2組（n=12），實驗前飼喂卡那霉素水溶液（1 g·L-1）4 d，3 d后建立大鼠牙周炎模型。牙周炎組：10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉下結扎絲結扎大鼠右側上頜第一磨牙，將100μLP.gingivalis（濃度為1×109CFU·mL-1）懸浮于CMCNa中并接種于大鼠第一磨牙齦溝內，每隔1 d接種1次，每周3次，根據前期研究建模6周[10]。對照組以等體積2%CMC-Na接種于相同部位。6周后10%水合氯醛麻醉下處死大鼠，取其肝組織進行后續實驗。

1.2.2 牙周檢查 肉眼觀察各組大鼠右側上頜第一磨牙牙齦情況，檢查牙周探診深度（probing depth，PD）、牙齒松動度（tooth mobility，TM）、齦溝出血指數（sulcus bleeding index，SBI）。用牙周探針測量大鼠右側上頜第一磨牙頰腭側近中、正中及遠中牙周袋底或齦溝底至齦緣的距離，取其平均值以記錄PD。用鑷子檢查第一磨牙頰腭、近遠中及垂直方向是否松動以記錄TM，TM評價標準：＜Ⅰ度，生理活動度；Ⅰ度，僅頰腭方向松動；Ⅱ度，頰腭及近遠中方向松動；Ⅲ度，頰腭、近遠中及垂直方向均松動。牙周探針檢查牙齦出血情況，根據Mazza法記錄SBI，計分標準如下：牙齦健康為0；牙齦輕度水腫，探診未出血為1；探診后呈點狀出血為2；探診出血沿齦緣擴展為3；出血溢出齦溝為4；自動出血或有潰瘍為5。

1.2.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 取部分肝組織置于10%中性甲醛固定液中24～48 h，常規脫水，石蠟包埋，切片（3μm），二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，顯蘭液返藍，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.2.4 qRT-PCR 取部分肝組織于液氮下研磨，Trizol試劑提取肝組織總RNA。根據TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄為互補脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）。使用SYBR Prime-ScriptTMRT-PCR試劑盒，以cDNA為模板，β肌動蛋白為內參，檢測P gc-1α、Nrf2、T fam基因表達，引物序列見表1。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火30 s，循環數為40。每個樣本設3個復孔，取平均值，2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

表1 qRT-PCR引物Tab 1 Primer sequence used for qRT-PCR

1.2.5 免疫組織化學檢測 使用免疫組織化學檢測肝組織中PGC-1α蛋白表達水平。石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，磷酸緩沖鹽溶液（phos‐phate buffer saline，PBS）沖洗，抗原修復，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min，PBS沖洗，滴加封閉劑室溫孵育10 min，傾去封閉劑勿洗，滴加一抗PGC-1α（1∶200稀釋），4℃過夜。PBS沖洗，加生物素標記山羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobin，Ig）G聚合物室溫孵育10 min，PBS沖洗，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育10 min，PBS沖洗，DAB顯色（鏡下觀察），流水沖洗終止反應，蘇木素復染、脫水、透明、封片，光學顯微鏡觀察。

1.3 統計學分析

應用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，數據結果用xˉ±s表示，采用t檢驗統計方法分析組間差異，TM及SBI采用曼-惠特尼U檢驗分析數據，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建立大鼠牙周炎模型

本研究通過結扎絲結扎聯合齦溝內接種P.gingivalis法成功建立大鼠牙周炎模型，見圖1，箭頭所示牙周炎組中大鼠的右上頜第一磨牙牙齦紅腫，質地軟；對照組中大鼠第一磨牙牙齦呈粉紅色，齦緣菲薄，質地韌。

圖1 大鼠牙周組織情況Fig 1 Periodontal condition of rats

2.2 牙周檢查結果

檢查各組牙周臨床指標，牙周炎組可探及不同深度的牙周袋，牙齒有不同程度松動，探診出血，對照組未見異常，見表2。

表2 牙周臨床指標Tab 2 Periodontal clinical indexes

2.3 HE染色結果

光學顯微鏡下觀察肝組織病理變化情況，見圖2，箭頭所示牙周炎組大鼠肝組織中肝索排列紊亂，肝組織細胞見空泡性變，細胞間見大量炎癥細胞浸潤。相反，對照組大鼠肝組織中肝索排列整齊，肝組織細胞未見明顯異常。

圖2 大鼠肝組織HE染色Fig 2 The HE staining of liver tissues in rats

2.4 qRT-PCR結果

與對照組相比，牙周炎組P gc-1α、Nr f2及T fam的mRNA表達水平均明顯降低，差異有統計學意義，見表3。

表3 大鼠肝組織Pgc-1α、Nrf 2及T fam的mRNA表達情況Tab 3 The mRNA expression of P gc-1α,Nr f2 and T fam in liver tissues of rats

2.5 免疫組織化學檢測結果

免疫組織化學檢測結果見圖3，大鼠肝組織細胞中棕黃色顆粒表示PGC-1α蛋白呈陽性表達，箭頭所示對照組PGC-1α廣泛分布于肝組織細胞的胞漿中，而牙周炎組中僅有個別肝組織細胞胞漿呈陽性，大部分肝細胞呈陰性。因此，牙周炎組中大鼠肝組織PGC-1α蛋白表達水平較對照組明顯降低。

圖3 大鼠肝組織免疫組織化學檢測結果Fig 3 The results of immunohistochemistry detection of liver tissues in rats

3 討論

研究[11]表明：P.gingivalis可引起口腔局部微生態紊亂，通過直接轉移定植進入血液循環系統或間接激發全身炎癥反應影響機體健康。Costa等[12]在臨床調查中發現，肝硬化患者的牙周炎發病率高達62.2%；其次，在NAFLD患者的肝組織活檢標本中可檢測到P.gingivalis，此外P.gingivalis可加劇高脂飲食誘導小鼠脂肪性肝炎的進程[13]。進一步研究[14]表明，高脂飲食誘導的大鼠牙周炎模型其肝組織出現炎癥細胞浸潤、纖維化、肝小葉變性及局部壞死等病理表現；本課題組前期研究[15]顯示，炎癥介質Toll樣受體4、髓樣分化因子88和核因子κB等參與結扎誘導大鼠牙周炎伴肝損傷的過程，而肝損傷可進一步發展為肝纖維化、肝硬化和肝癌等[16]，極大影響生命健康。

為了更好地研究牙周炎與肝損傷之間的關系，本研究采用結扎聯合P.gingivalis齦溝內接種法構建大鼠牙周炎模型，組織學方法檢測大鼠肝組織可見肝細胞內大量空泡性變，并伴有炎癥細胞浸潤。另外Dos Santos Carvalho等[17]發現，結扎誘導的大鼠牙周炎相比對照組其肝組織中氧化應激產物丙二醛表達水平明顯升高，抗氧化產物谷胱甘肽表達水平顯著降低，肝組織出現脂肪性變。研究[18]證實，在牙周組織炎癥狀態下，主要由中性粒細胞過量產生的ROS引起氧化應激反應，造成組織損傷；而線粒體是細胞中ROS的主要來源和直接作用靶點[19]。Vasconcelos等[20]發現，牙周炎大鼠肝組織出現氧化損傷并伴有線粒體腫脹、破碎，由此推測氧化應激損傷可能在牙周炎誘發肝損傷中起重要作用。

PGC-1α是線粒體功能及生物合成的重要轉錄輔助激活因子，也是清除線粒體中ROS的主要介質[21]。本次研究結果發現牙周炎大鼠肝組織中PGC-1α基因及蛋白表達水平與對照組相比顯著下降，其下游因子Nrf2、Tfam[6]的mRNA表達水平也明顯降低。研究[22]發現，牙周炎主要致病毒力因子P.gingivalis-LPS可誘發人牙齦成纖維細胞的線粒體功能障礙并明顯降低PGC-1α的蛋白表達水平。此外Singh等[23]研究發現，P.gingivalis可顯著促進PGC-1α敲除小鼠脂肪細胞內腫瘤壞死因子-α的表達水平，降低抗氧化酶錳超氧化物歧化酶的表達水平，從而加重細胞損傷。另外，Sánchez-Ramos等[24]體內研究表明，高脂飲食誘導的小鼠脂肪肝模型中PGC-1α表達水平顯著下降。以上結果均提示，PGC-1α及其下游因子可能參與了牙周炎誘發大鼠肝損傷的過程。

本研究通過結扎聯合P.gingivalis齦溝內接種法構建大鼠牙周炎模型，初步認為牙周炎可誘發大鼠肝損傷，而PGC-1α及其下游因子可能參與牙周炎誘發大鼠肝損傷的過程，但其具體機制還有待進一步研究。期待為牙周炎誘發肝損傷的機制提供新思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。