能量代謝在成骨和破骨細胞中的研究

石玉

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫學院，成都610041

骨量丟失與骨質疏松導致的骨折一直是威脅人類健康尤其是中老年人健康的主要疾病，根據國家衛生健康委員會調查的結果顯示，骨質疏松癥已經成為中國50歲以上人群的重要健康問題，中老年女性骨質疏松問題尤為嚴重。隨著中國人口老齡化的進程，患有骨質疏松癥的患者人數將迅速增加。更為嚴重的是，調查還發現，中國低骨量人群龐大，是骨質疏松癥的高危人群，但是因為早期骨量丟失病癥不明顯，并沒有引起人們的足夠重視，耽誤了病癥的治療[1]。盡管近些年來，越來越多的科研工作結合臨床治療開發了多種藥物，例如針對RANKL的藥物地舒單抗（De‐nosumab），二磷酸鹽類藥物以及美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）批準的新藥TYMLOS（abaloparatide）注射液等等，在一定程度上對治療骨質疏松起到有效作用。但是，隨著用藥療程的延長，藥效減弱、藥物安全性以及藥物對機體的不良反應漸漸引起人們的關注[2-3]。因此，尋找更為有效的治療方案成為本領域的研究重點和熱點。成骨細胞以及破骨細胞是骨骼系統中重要的細胞類型，直接參與并影響成年個體的骨骼重建。由成骨細胞介導的骨形成以及由破骨細胞介導的骨吸收共同調控著骨穩態；如果骨形成與骨吸收的平衡被打破，極易造成骨量丟失，進而導致骨質疏松的發生。因此，研究對成骨細胞和破骨細胞的分化、活性和功能的調控機制對于更好地了解骨質疏松的發病原理以及發現新的治療方案至關重要。在研究細胞分化過程中，以往的研究大多集中于研究內分泌、旁分泌信號或者轉錄因子如何調控成骨、破骨細胞的特異基因表達水平，從而促進或是抑制其分化[4-7]。但是細胞分化過程中的另外一個重要特征往往被忽略，那就是細胞如何獲得特定的生物學功能，比如成骨細胞沉積膠原、破骨細胞分泌蛋白酶等，這一過程涉及到大量的能量代謝調控；目前，對于這方面的研究還處于起步階段[8]。這篇綜述將總結目前能量代謝主要是葡萄糖代謝是如何調控成骨、破骨分化這一重要生物學過程的。

1 葡萄糖代謝和成骨細胞

間充質干細胞經過一系列的分化過程最終分化成為成骨細胞，同時在不同階段表達特異的分子標記物[4]。成骨細胞成熟后附著在骨表面，一些最終被包被在骨基質中成為骨細胞或者成為骨襯細胞，還有一部分發生凋亡，被機體代謝掉（圖1）。目前，對于間充質干細胞以及前體細胞分化成為成骨細胞的調控機制研究，已經有了明顯的進展，但是對于細胞水平上能量代謝如何影響成骨細胞生物學功能的研究還處于起步階段。

圖1 成骨細胞以及破骨細胞Fig 1 Osteoblasts and osteoclasts

眾所周知，氧化磷酸化與糖酵解相比，可以產生更多的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）。但是研究表明，成骨細胞在氧氣充足的情況下更傾向于使用有氧糖酵解方式將葡萄糖轉化為乳酸[9]，而不是使用三羧酸循環代謝葡萄糖。此現象最早在骨片培養和離體骨細胞培養中被檢測到[10-12]；后續研究[13-14]發現，顱蓋骨前體細胞在β-甘油磷酸鈉以及抗壞血酸聯合促進成骨分化過程中，有氧糖酵解明顯增強。有意思的是，在成熟的成骨細胞中存在更多的線粒體，但是這并沒有改變細胞傾向于使用有氧糖酵解的頻率[15-16]。近期研究[17]還發現，在成骨細胞中葡萄糖的有氧糖酵解反應產生能量占到80%左右，并且隨著成骨細胞的成熟，線粒體呼吸反應逐漸減弱，有氧糖酵解成為主要的能量獲取方式。這些數據證明，葡萄糖的代謝方式會發生明顯的改變以適應細胞在分化過程中對能量的需求。但是目前，對于成骨細胞為何傾向于使用有氧糖酵解途徑代謝葡萄糖仍然不清楚。很可能，有氧糖酵解途徑產生更多的用于成骨細胞分化的中間代謝產物，這些產物有利于成骨細胞內活躍的合成反應。此外，糖酵解被證明可以有效降低氧化磷酸化中活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的產生，有效地阻止了干細胞向脂肪細胞的分化過程[18-19]。另外一種可能是，有氧糖酵解過程直接改變了表觀遺傳修飾過程中的酶或是底物的水平[20-21]，從而在干細胞定向分化中起到關鍵作用；例如，Wnt信號降低了細胞核內的檸檬酸以及乙酰輔酶A的水平，這也解釋了為何Wnt可以大規模抑制組蛋白乙酰化水平，從而抑制間充質干細胞向脂肪、軟骨方向的分化能力[22]。

近期有越來越多的文章證明，有氧糖酵解在成骨向細胞中直接被多種關鍵的分子通路所調控。目前有文獻指出，在治療骨質疏松癥中最為常用的藥物——甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）類藥物，可以促進骨片的葡萄糖吸收以及乳糖的產生[23-24]。在機制層面有文章[25]報道，PTH信號通路通過間接調控胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，Igf1r）增強有氧糖酵解，這一過程通過mTORC2介導；通過藥物DCA降低有氧糖酵解水平，可以促進丙酮酸更多地進入三羧酸循環，從而抑制PTH對間充質干細胞成骨分化的促進作用以及PTH對骨量的增加效果。為了進一步闡述有氧糖酵解和骨形成之間的關系，科學家在小鼠體內過表達促進有氧糖酵解的低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，Hif）1α，結果發現，這一操作明顯地促進了骨形成；更為重要的是，注射DCA藥物抑制有氧糖酵解的同時，顯著的逆轉了Hif1α引起的骨量增加，這一部分數據更加有力地證明了有氧糖酵解在體內對骨量增加的促進作用[26]。除了促骨形成的PTH通路之外，Wnt以及Notch等在骨發育中不可或缺的信號通路同樣可以通過調控糖酵解，進而引起骨量的改變。Wnt家族蛋白是骨形成過程中研究最為全面的分子之一，Wnt3a-Lrp5信號級聯反應，可以迅速地升高糖酵解過程中的轉運蛋白以及催化酶，比如葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter，Glut）1、HK2、乳酸脫氫酶（lactate dehydroge‐nase，Ldh）a以及Pdk1等的mRNA和蛋白水平，并且這些基因被Wnt3a下游的mTORC2所調控。升高Glut1和HK2的表達水平可以提升有氧糖酵解的效率，同時Ldha以及Pdk1的升高有利于丙酮酸轉化為乳糖，最終促進成骨細胞分化[27]。Notch家族被認為是控制細胞命運的重要信號，之前的研究[28-29]指出，Notch維持骨髓間充質干細胞群體，同時抑制干細胞的成骨分化。近期文獻報道，通過Jagged1或是Notch2胞內部分（NICD）激活Notch通路，可以顯著抑制骨髓間充質干細胞的葡萄糖代謝和成骨細胞分化；體內實驗證明，特異的在四肢骨間充質干細胞中敲除Notch2可以增加有氧糖酵解以及骨形成。在機制層面，有研究[30]還揭示了Notch通過AMP依賴的蛋白激酶（ade‐nosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK）通路調控這一表型。另一個骨骼發育重要的調控分子Hedgehog通路被報道通過非經典途徑，在肌肉和棕色脂肪組織中，促進了有氧糖酵解[31]。雖然Hedgehog對成骨細胞的糖代謝方式還沒有明確研究，但是有工作[32]指出Hedgehog通路可以通過mTORC2促進骨形成；同時mTORC2又被多次報道是糖代謝途徑中重要的調控因子。因此，研究Hedgehog在有氧糖酵解和骨形成中的調控機制，以及三者之間的關系，將對深入了解Hedgehog通路十分重要（圖2）。

圖2 成骨分化細胞信號通路與糖代謝Fig 2 Signal pathway of osteoblast differentiation cells and glucose metabolism

除了成骨細胞，終末分化的骨細胞生物學功能同樣受到糖代謝的調控。骨細胞可以分泌骨鈣素和核因子κB受體活化因子配體（receptor activa‐tor of nuclear factor-κB ligand，RANKL），前者對骨穩態維持至關重要，而后者則調控著破骨細胞的活性。最新研究指出，MLO-Y4-A2骨細胞系表達Glut1基因，并且骨細胞在Glut1抑制劑phloretin作用下，明顯減少對葡萄糖的攝取，進而通過AMPK通路降低骨細胞骨鈣素和RANKL的分泌量。這些數據提示，降低骨細胞葡萄糖攝取可以通過降低骨鈣素表達以及抑制RANKL誘導的骨吸收來維持骨穩態[33]。

2 葡萄糖代謝和破骨細胞

破骨細胞分化自造血細胞，是一種個體大、多細胞核、在體內負責吸收骨基質的細胞，同時也是維持骨穩態的主要細胞種類。巨噬細胞經過巨噬細胞克隆刺激因子（macrophage-colony stimu‐lating factor，M-CSF）以及RANKL的作用逐漸分化成為破骨細胞[7]（圖1）。

不同于間充質干細胞的成骨分化，在RANKL刺激巨噬細胞向破骨前體細胞分化的過程中，氧化磷酸化以及有氧糖酵解都有明顯增加[34]。此前研究[35]顯示，氧化磷酸化被抑制會造成破骨前體細胞向成熟破骨細胞分化的阻滯。體內敲除參與氧化磷酸化的Ndufs4基因，可以有效阻止破骨細胞的分化，最終導致骨硬化病[36]。此外，利用Ca‐thepsin K重組酶小鼠模型，特異性敲除線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，Tfam）明顯地降低了破骨細胞的胞內ATP水平，同時促進了其凋亡[37]。

另一方面近期研究指出，破骨細胞成熟過程中有氧糖酵解的產物——乳酸也有明顯增加；隨后的體內實驗證明，在破骨前體細胞中特異敲除Glut1基因，導致有氧糖酵解減弱，雖然氧化磷酸化水平無明顯缺陷，但是這一敲除實驗導致了破骨形成障礙[38]。并且，體內敲除有氧糖酵解重要的催化酶Ldha或者Ldhb，會減弱糖酵解和氧化磷酸化，引起破骨細胞形成障礙[39]。這些結果都說明，線粒體呼吸與糖酵解在破骨細胞分化這一過程中發生偶聯反應，共同影響其分化與最終成熟。

到目前為止，葡萄糖不僅被認為是調控破骨細胞分化與形成的主要能量來源，而且對成熟的破骨細胞發揮其生物學功能也是十分重要的。早期研究[40]證明，雞的破骨細胞需要葡萄糖作為能量來源發揮骨吸收的作用，在骨表面的成熟破骨細胞明顯的增強了對葡萄糖的攝取量。隨后，該實驗室的科學家[41]同樣使用雞的破骨細胞作為研究對象，發現用于反映破骨細胞骨吸收活力的VATPase基因的蛋白和mRNA水平都有明顯的增加。與成骨細胞類似，在培養基內減少葡萄糖或是在小鼠體內特異的敲除Hif1α都可以有效的降低破骨細胞的骨吸收能力[42]。免疫熒光研究[36]顯示，一些糖酵解中重要的酶富集在破骨細胞極化反應后的細胞肌動蛋白環附近。這說明，不同于破骨細胞分化過程需要線粒體的氧化磷酸化、糖酵解以及其他代謝產物提供能量，成熟的破骨細胞更依賴活躍的糖酵解來發揮骨吸收的作用。但值得注意的是，在培養基中降低葡萄糖含量或是敲除Hif1α導致的糖酵解減弱，并不能導致破骨細胞形成異常。這說明，對于破骨細胞形成過程中能量來源，除了葡萄糖外，還有多種替代途徑[42]。

3 其他能量代謝與成骨、破骨細胞形成

3.1 谷氨酰胺

在人類細胞質中，谷氨酰胺的濃度維持在500～750μmol·L-1，是人體外周循環中最為豐富的氨基酸[43]。在作為蛋白質合成的主要參與者的同時，谷氨酰胺還作為機體中合成氨基酸、核酸、谷胱甘肽以及己糖胺等重要碳與氮原子的提供者[44-46]。盡管谷氨酰胺作為非必需氨基酸，機體可以合成，但是研究[47]證明其在腫瘤細胞中的代謝率遠遠高于其他的非必需氨基酸。到目前為止，越來越多的研究表明，谷氨酰胺的代謝在成骨細胞形成與功能中十分重要。起初，研究[48]發現，長骨和頭蓋骨碎片在培養狀態中持續吸收谷氨酰胺；在隨后的報道[49]中，谷氨酰胺被發現參與了顱骨前體細胞的基質鈣化過程。更重要的是，使用同位素標記的谷氨酰胺進行示蹤實驗[50]，發現其通過三羧酸循環轉化為檸檬酸，進而促進了成骨前體細胞線粒體中的能量代謝。最新研究[51]顯示，在骨骼干細胞向成骨細胞分化過程中，谷氨酰胺代謝后的α-酮戊二酸可以促進骨骼干細胞的氨基酸合成以及增殖；體內實驗指出，特異的在骨骼干細胞中阻斷谷氨酰胺代謝抑制骨形成并且增加骨髓脂肪含量。

在破骨分化過程中，首先科學家[52]發現低氧狀態有利于破骨細胞對谷氨酰胺的吸收。隨后有文獻[42]報道，升高谷氨酰胺可以增強破骨細胞的形成能力；同時研究指出相比于分化的初期，谷氨酰胺對成熟過程中的破骨細胞更為重要。近期研究通過轉錄組學分析發現，谷氨酰胺代謝而來的α-酮戊二酸在上調Slc7a11（半胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白亞基）的同時，降低破骨細胞特異基因的表達。在機制方面，α-酮戊二酸通過去除Slc7a11啟動子區上抑制型組蛋白H3K9甲基化修飾，同時增加與Nrf2的結合，從而增加Slc7a11的表達。由于Slc7a11可以通過谷胱甘肽的輸入抑制ROS的水平，因此文章中測定了細胞內ROS，發現RANKL誘導ROS的產生可以被α-酮戊二酸—Slc7a11通路所抑制。因此，谷氨酰胺代謝而來的α-酮戊二酸在破骨細胞形成的過程中起到負調控作用[53]。

3.2 其他常見氨基酸

除了谷氨酰胺以外，其他的氨基酸也被證明參與了成骨細胞的分化。成骨分化的重要調控因子Atf4可以提升對氨基酸的攝取以及膠原的合成，在Atf4突變引起的Coffin-Lowry綜合征患者體內，骨量與骨密度都明顯降低[54-55]。在前體細胞中，精氨酸可以促進成骨分化[56]；而亮氨酸、異亮氨酸以及纈氨酸的代謝雖然在成骨分化中沒有明確報道，但是在成脂肪分化中起到關鍵作用[57]。這些結果證明，氨基酸代謝對于前體細胞定向分化不可或缺。

3.3 脂肪酸

脂肪酸存在于循環系統中，包括骨髓血清中，其濃度依據不同組織會有差別[58]。脂肪酸一般認為是來源于機體儲存的甘油三酯以及脂滴發生脂解作用后的產物，隨后分泌到循環系統中；也有報道[59]，過氧化物酶體可以合成一些長鏈的脂肪酸，而這些脂肪酸可以在成骨分化過程中促進細胞增殖。最終，脂肪酸在線粒體中發生降解并產生ATP，為成骨分化提供能力。有文獻[60]報道，長鏈飽和脂肪酸，例如棕櫚酸脂可以抑制顱骨前成骨細胞的分化；但是非飽和脂肪酸-油酸脂卻可以緩解棕櫚酸酯在成骨過程中的副作用[61]。體外實驗[62]中，Wnt-Lrp5通路增強了脂肪酸的氧化反應，有利于成骨細胞的分化；體內實驗[63]證明，給模式動物喂食長鏈非飽和脂肪酸有利于骨骼發育。在破骨形成方面，體外誘導模型中，非飽和脂肪酸通過FFAR4/β-arr2途徑抑制破骨細胞分化[64]。在牙齦卟啉單胞菌誘導的小鼠牙周炎模型中，骨吸收加劇，破骨細胞活性增強，omega-3非飽和脂肪酸的攝取可以明顯的降低破骨細胞的數目；ome‐ga-3非飽和脂肪酸的衍生物RvE1可以抑制破骨細胞體外分化[65]。去卵巢大鼠因為雌激素水平降低，表現為骨量下降，是常用的研究破骨細胞活性以及骨吸收能力的動物模型；在去卵巢大鼠體內抑制脂肪酸合成酶，可以有效降低破骨細胞的活性，減少骨量丟失[66]。這些結果闡述了脂肪酸在骨穩態維持中的重要性。

3.4 丙酮酸

丙酮酸被認為是葡萄糖代謝中重要的中間產物，它通過線粒體丙酮酸轉運體進入線粒體中，定向于線粒體內膜上，通過三羧酸循環產生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleo‐tide，NAD）和還原型黃素二核苷酸（flavine ade‐nine dinucleotide,reduced，FADH2）。在顱骨成骨前體細胞中，外源性地加入丙酮酸可以顯著提升氧耗量，同時通過氧化磷酸化過程增加ATP的產量[17,49]。這一過程不僅對成骨細胞分化與功能十分重要，并且也將有效提升破骨細胞的形成。在培養基中補充丙酮酸，在提高線粒體呼吸的同時，通過細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和RANKL通路協同促進破骨細胞形成[35]；這一發現也被后續的體內研究[67]所證明，為小鼠連續注射丙酮酸，可以增加脛骨中破骨細胞數目以及活力。因此，丙酮酸代謝對破骨細胞介導的骨吸收以及成骨細胞介導的骨形成都是有利的。

4 糖代謝異常與骨骼疾病的相關性

糖尿病常常伴隨著復雜的骨骼疾病，比如骨密度降低、容易骨折以及骨折后修復遲緩等[68]。之前的報道大多關注糖尿病引起的成骨細胞異常以及骨形成缺陷，近期的研究[69-72]證明，骨吸收在糖尿病患者中也被發現有明顯的改變。在糖尿病模式動物中，破骨細胞的增多以及骨吸收的增強很可能不是全身性的升糖反應直接導致，更可能是因為骨髓中的低氧誘導酸中毒所致[73]。除此之外，脂質以及蛋白質代謝產物會導致高血糖的發生，隨后通過膜上糖基化終產物受體（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）蛋白加強骨吸收[74]，而RAGE的激活會使得ROS積累，進而通過RANKL對破骨細胞的形成發揮正反饋的功能[75]；同時ROS的增加反作用于成骨細胞，導致其分化受阻以及凋亡加劇[76-77]。

機體利用能量維持組織內穩態以及合成代謝活動，因此營養不良會導致全身代謝的顯著變化。神經性食欲缺乏癥的特征為機體能量供給不足，導致全身性的能量代謝紊亂、骨形成異常、易骨折等，但奇怪的是，破骨細胞介導的骨吸收作用卻在這種癥狀中被發現有明顯的增強，患有此類疾病的患者骨量減少，血糖降低，同時伴隨有骨髓脂肪增多的現象[78]。激素的水平變化被認為是原因之一，在絕經的女性體內，雌激素的缺失不僅可以增加骨髓脂肪細胞的形成，還可以降低骨量。目前，對于在嚴重營養貧乏的情況下，前成骨細胞的能量代謝調控機制仍然不明；并且這種在營養缺失嚴重情況下的脂肪增多現象是否由于能量代謝異常導致前體細胞從成骨向分化轉為成脂肪向分化，也有待研究。

5 總結

恰當的能量代謝方式和調控程序對于骨骼發育以及穩態維持中的各種細胞都是不可或缺的；同時代謝中涉及到的各種產生能量的底物在細胞分化的不同階段使用效率也各不相同。據報道，成骨細胞形成過程中的葡萄糖代謝是能量供給最主要的來源，并且Wnt、胰島素樣生長因子、Notch以及PTH等通路都被報道可以調控這一過程。破骨細胞形成與發揮功能同樣受到糖代謝的調控，并且不同階段使用糖代謝方式亦不相同。除此之外，盡管關于氨基酸、脂肪酸以及檸檬酸等營養分子對成骨、破骨細胞形成有初步探討，但是仍有很多細節有待研究。

阻礙骨骼系統中能量代謝方面研究進程的原因很多，其中最為重要的是科學家很難在體外模擬骨髓中的微環境。體外人為模擬的分化條件雖然已為本領域的研究做出重大貢獻，但是營養物質之間的代償作用以及細胞在不同的分化階段利用的營養物質比例并不相同等因素都無法在體外模擬出來。在研究例如糖尿病等代謝疾病的過程中，科學家發現，糖尿病模型中的成骨細胞使用能量以及利用營養物質的方式發生明顯改變；報道也指出在使用藥物治療糖尿病的同時，成骨細胞使用能量的方式也隨即發生變化。這些結果都提示，成骨細胞以及破骨細胞在能量代謝過程中都可以十分巧妙的依據微環境中當時存在的營養物質進行代謝過程，以確保其正常的生理功能。今后，對于其他骨相關細胞，比如骨細胞、骨襯細胞以及骨髓脂肪細胞等在能量代謝方面的深入探討，將豐富對骨骼系統的認識，也將成為今后本領域的重點之一。除此之外，更為先進的科學儀器以及更加精準的測量方式將為科研工作提供更為準確的數據，也是推動領域進步的重要環節。依靠這些技術以及基礎知識，希望今后可以將骨骼系統細胞的能量代謝研究應用于骨相關疾病的臨床治療和藥物開發中。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。