加味茵陳蒿湯通過抑制TLR4信號通路對大鼠急性肝損傷的保護作用

周興華,龔道銀,鐘 森

(1成都中醫藥大學附屬醫院肛腸科,成都 610072;2成都中醫藥大學附屬醫院病理科;3成都中醫藥大學附屬醫院感染科;*通訊作者,E-mail:zhongsen6606@163.com)

茵陳蒿湯始載于《傷寒雜病論·黃疸篇》,是治療濕熱黃疸的經方,本方由茵陳蒿、梔子、大黃三味藥組成,方中用茵陳蒿清熱利濕退黃;梔子清解三焦邪熱;大黃泄熱通便,兼顧活血化瘀,諸藥共湊清熱利濕退黃之效[1-3]。導師鐘森在前人基礎上結合自己多年臨床經驗,將唐代藥王孫思邈《千金藥方·黃疸》中的茵陳蒿湯靈活運用于實踐,療效顯著。已有研究表明TLRs/核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路廣泛參與肝損傷的病理過程,TLR4、MyD88、p-NF-κB及TNF-α蛋白是TLRs/NF-κB信號通路中的關鍵蛋白[4,5]。因此,本實驗采用D-氨基半乳糖誘導急性肝損傷模型,觀察TLR4、MyD88、p-NF-κB及TNF-α蛋白表達的變化,并探討加味茵陳蒿湯對急性肝損傷大鼠的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SD雌性大鼠,SPF級,42只,體質量180-220 g,由成都達碩生物科技有限公司提供,實驗動物許可證號SCXK(川)2008-24。飼養于四川省人民醫院屏障級實驗動物中心,食用統一購制標準丸狀飼料,飲自來水,室溫15-20 ℃,相對濕度60%-80%的實驗室。

1.2 肝臟損傷模型的構建及分組

實驗前，所有大鼠均適應性喂養1周。除空白組外，其余各組大鼠腹腔一次性注射D-GaIN(700 mg/kg)/LPS(10 μg/kg)以造成急性肝損傷模型。大鼠按體質量用隨機數字表法分為7組，每組6只，分別為：①模型組：灌胃等體積生理鹽水，2次/d，連續給藥2周；②西藥組：灌胃復方甘草酸苷15.75 mg/kg，2次/d，連續給藥2周；③中藥組：灌胃加味茵陳蒿湯58.8 g/kg，2次/d，連續給藥2周；④空白組：灌胃等體積生理鹽水，2次/d，連續給藥2周；⑤TLR4過表達組：造模后靜脈注射0.5 ml腺病毒包裝的TLR4過表達載體(pDC-TLR4,1×1011PFU)，1次/周，連續給藥2周；⑥西藥+TLR4過表達組：大鼠靜脈注射pDC-TLR4 0.5 ml，1次/周，之后灌胃復方甘草酸苷15.75 mg/kg，2次/d，連續給藥2周；⑦中藥+TLR4過表達組：大鼠靜脈注射pDC-TLR4 0.5 ml，1次/周，之后灌胃加味茵陳蒿湯58.8 g/kg，2次/d，連續給藥2周。實驗結束后大鼠股動脈放血處死動物，迅速剖取大鼠肝臟，將其置于冰盤上，于生理鹽水中洗凈血跡后，裝于DEPC水處理過的EP管中，放置液氮中快速冷凍，然后轉移至-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.3 受試藥物

加味茵陳蒿湯處方:茵陳30 g,梔子30 g,酒大黃15 g,黃連15 g,黃芩15 g,黃芪30 g,赤芍30 g,藥材均來自成都中醫藥大學附屬醫院名醫堂,由成都中醫藥大學藥學院藥劑教研室制備。復方甘草酸苷片(批號20191014,日本米諾發源制藥株式會社山片劑株式會社)。

1.4 試劑和儀器

ALT及AST試劑盒:中生北控生物科技股份有限公司(批號:090302,090273);D-GalN(純度>99%,Sigma公司,批號1772-03-9),臨用前用生理鹽水配置成10%的溶液,用1 mmol/L NaOH調pH至7.0;腺病毒包裝的TLR4過表達載體(pDC-TLR4,1×1011PFU);BS-600L電子天平(上海友聲衡器有限公司);PIKORed96 RT-PCR擴增儀(美國ThermoFisher儀器有限公司);DY89-I型勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司);UK-33型垂直電泳槽(美國Bio-RAD公司);UV Transilluminator化學發光凝膠成像儀(美國Bio-RAD公司)。

1.5 指標檢測

1.5.1 大鼠血清ALT、AST水平的測定 大鼠血清中ALT和AST的測定采用酶動力學法,由全自動生化分析儀進行檢測。

1.5.2 HE染色檢測大鼠肝臟組織的病理狀態 各組大鼠肝臟組織,用10%中性甲醛溶液固定、梯度乙醇(50%-100%)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后,制成5 μm厚切片。將切片在二甲苯中脫蠟后,采用蘇木精-伊紅(HE)染色,脫水,中性樹脂封片。在高倍顯微鏡下觀察肝組織病理學變化。

1.5.3 Western blot分析TNF-α、MyD88、p-NF-κB及TLR4的表達水平 用RIPA裂解液各組大鼠肝臟組織,提取總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度,10% SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h,隨后按照適當比例加入一抗(兔單抗TNF-α(#ab183218,Abcam,1 ∶1 000)、兔單抗MyD88(#ab183218,Abcam,1 ∶1 000)、兔單抗p-NF-κB(phospho S536,#ab76302,Abcam,1 ∶1 000)及TLR4(#ab22048,Abcam,1 ∶1 000)于4 ℃封閉過夜,第2天加入對應二抗室溫封閉1 h,最后滴ECL進行曝光,曝光顯色后的蛋白,Bio-Rad全功能成像系統采集圖像,Image-ProPlus分析光密度,以β-actin(#BM0627,Boster,1 ∶1 000)為內參,計算各組蛋白質的相對表達量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST檢測結果

與空白組比較,模型組大鼠血清ALT、AST含量顯著升高(P<0.01);與模型組比較,中藥組和西藥組大鼠血清ALT、AST含量均有顯著降低(P<0.01);另外,與模型組相比,TLR4過表達組大鼠血清ALT、AST含量均有升高趨勢,但無統計學差異;與西藥組相比,西藥+TLR4過表達組顯著逆轉了西藥對大鼠血清ALT、AST含量的下調作用(P<0.01);與中藥組相比,中藥+TLR4過表達組顯著阻止了中藥對大鼠血清ALT、AST含量的下調作用(P<0.01,見圖1)。

與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與西藥組比較,△△P<0.01;與中藥組比較,&&P<0.01圖1 各組大鼠血清ALT、AST水平Figure 1 The levels of ALT and AST in serum of rats in each group

2.2 各組大鼠肝組織TNF-α、p-NF-κB、MyD88、TLR4蛋白表達的結果

與空白組比較,模型組大鼠肝組織中TNF-α、p-NF-κB、MyD88、TLR4含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,中藥組和西藥組大鼠肝組織TNF-α、p-NF-κB、MyD88、TLR4含量均有顯著降低(P<0.01)。另外,與模型組相比,TLR4過表達組大鼠肝組織TNF-α、p-NF-κB、MyD88、TLR4水平均顯著升高(P<0.01);與西藥組相比,西藥+TLR4過表達組顯著促進了大鼠肝臟組織中TNF-α、p-NF-κB、MyD88和TLR4的表達(P<0.01);與中藥組相比,中藥+TLR4過表達組顯著增強了大鼠肝臟組織中TNF-α、p-NF-κB、MyD88、TLR4的表達水平(P<0.01,見圖2)。

與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與西藥組比較,△△P<0.01;與中藥組比較,&&P<0.01圖2 各組大鼠肝組織TNF-α、p-NF-κB、MyD88、TLR4蛋白表達的結果Figure 2 Expression of TNF-α, p-NF-κB, MyD88, TLR4 in liver tissues of rats in each group

2.3 肝臟病理學變化

HE染色結果顯示,模型組大鼠肝細胞呈彌漫性大片狀壞死,肝竇結構被破壞,中央靜脈和匯管區可見大量炎癥細胞浸潤,說明造模成功;與模型組比較,中藥組和西藥組肝細胞壞死均有改善;其次,與模型組相比,TLR4過表達組大鼠肝組織炎性癥狀有加重的趨勢,肝細胞呈彌漫性大片狀壞死;與中藥組和西藥組相比,中藥+TLR4過表達組和西藥+TLR4過表達組均加劇了大鼠肝臟組織的炎性細胞浸潤情況(見圖3)。

圖3 各組大鼠肝組織病理學變化Figure 3 Histopathological changes of liver tissues in rats in each group

3 討論

中藥在肝損傷的治療中具有廣闊的研究前景,中藥活性單體和復方制劑均能通過調節免疫、提高抗氧化能力和降低炎癥等,維護肝細胞正常功能的發揮并減緩肝細胞凋亡。報道顯示,加味茵陳蒿湯對肝炎、肝硬化、肝動脈栓塞等肝臟疾病的治療上具有顯著成效。加味茵陳蒿湯聯合熊去氧膽酸可用于臨床治療原發性膽汁性肝硬化,并顯著改善患者的肝功能[6]。另外,加味茵陳蒿湯聯合阿德福韋酯在慢性乙型肝炎早期可緩解患者肝臟功能異常和黃疸[7]。本實驗利用急性肝損傷大鼠模型,進一步發現加味茵陳蒿湯可顯著改善大鼠肝臟功能,并顯著緩解肝臟組織的受損程度和炎性細胞浸潤。

TLRs是近年天然免疫系統熱點研究的一個受體家族[8],不僅在抗感染免疫中發揮重要作用,也參與自身免疫性疾病的發生發展。TLRs廣泛表達在肝實質細胞和非實質細胞上,通過門靜脈接觸大量病原體成分,與各種病原微生物分子結合,通過信號傳導激活各種免疫細胞,參與肝臟的生理病理過程[9-11]。MyD88是含有TLR結構域的接頭蛋白,屬于TLR信號通路中的下游信號分子,MyD88的磷酸化激活可以激活下游NF-κB分子的磷酸化[12,13]。TLR4/NF-κB信號通路活化后可合成大量TNF家族的炎癥因子,且這些因子均被證實與肝臟損傷密切相關。Bohgaki等[14]報道TLRs信號通路調節肝細胞內的絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)和NF-κB等信號轉導途徑,介導MIP-2、TNF-α和IFN-r等炎癥因子生成,加重肝損傷的程度。另有研究發現,漆黃素通過調控TLR4/NF-κB通路減輕大鼠肝細胞缺氧/復氧損傷[15]。此外,毒消肝清丸可降低肝硬化內毒素血癥大鼠肝臟組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及其mRNA的表達,最終對大鼠肝臟炎性損傷起到緩解作用[16]。白藜蘆醇能顯著減輕H/R誘導的BRL-3A肝細胞損傷,該保護作用可能與白藜蘆醇抑制TLR4/NF-κB信號通路傳導有關[17]。因此,通過藥物處理降低TLR4/NF-κB信號通路的活性是改善肝損傷的有效策略。與前人研究結果類似,本實驗結果表明,加味茵陳蒿湯可顯著下調肝組織TNF-α、p-NF-κB、MyD88及TLR4的蛋白表達,另外,TLR4的過表達顯著逆轉了加味茵陳蒿湯對大鼠肝損傷的改善作用。該研究結果提示加味茵陳蒿湯可能通過調節大鼠肝組織中TLR4信號通路,避免其下游通路NF-κB的活化,進而減少炎癥因子的釋放,從而減輕肝臟炎癥損傷。

綜上所述,加味茵陳蒿湯可以成功抑制D-GaIN刺激的大鼠急性肝臟功能損傷和肝臟細胞炎癥,其重要的作用機制之一是降低了TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活性,本研究為急性肝損傷的治療提供了新的策略。