中國山西漢族人群rs5888及rs1207568位點單核苷酸多態性與腦梗死合并糖尿病易感性的關系

趙辰生,西 穎,潘阿曉,劉玉婷,程 娜,王智云,柴秀琴,楊 陽,安麗榮,胡 濤

(1山西省心血管病醫院神經內科,太原 030024;2山西省人民醫院神經外科;*通訊作者,E-mail:namucuoo2000@sina.com)

腦梗死(cerebral infarction,CI)屬于臨床常見疾病,發病率、致殘致死率高,發病涉及多因素,對患者造成嚴重影響[1]。糖尿病(diabetes mellitus,DM)并發腦血管病的發生率為16.4%-18.6%,而糖尿病合并腦梗死占糖尿病并發腦血管病的89.1%;同時,約1/3的腦梗死患者患有糖尿病[2]。研究表明,遺傳基因在腦梗死發病中可能起重要作用。近年來,探討腦梗死的遺傳易感基因標記及基因多態性與腦梗死相關關系的研究越來越受到學者們的重視[3]。糖代謝異常是腦梗死的危險因素[4],大量研究均證實腦梗死的發生與2型糖尿病有關,其并發腦梗死的相對危險程度是非糖尿病患者的2-3倍[5]。血糖升高可引起脂代謝紊亂,同時引發組織蛋白非酶糖化,加速加重動脈粥樣硬化形成。

SCARB1基因全稱為scavenger receptor class B member 1,該基因編碼的蛋白質是高密度脂蛋白膽固醇(HDL)的質膜受體,編碼的蛋白質介導膽固醇與HDL的相互轉移。研究表明[6],HDL刺激清道夫受體B類1型(SR-B1)促進肝臟吸收膽固醇,而該受體正是由SCARB1基因編碼的。高密度脂蛋白對冠心病的臨床診斷是一個重要的參考指標。它的升高是臨床冠心病保護因子之一,并能防治和延緩動脈粥樣硬化的發展。因此,SCARB1基因的罕見突變與冠心病(CHD)相關[6]。Ma等[6]的研究搜索了病例對照研究和隊列研究的數據庫后認為,多態性rs5888與冠心病的發生呈負相關,尤其是在男性中表現尤甚。

KL基因全稱為Klotho,該基因編碼與β-葡萄糖苷酶有關的I型膜蛋白。2018年,Flotyńska等[7]的研究探討了1型糖尿病患者的Klotho蛋白功能。研究認為,成纖維細胞生長因子23(FGF23)和Klotho系統濃度的變化可能是糖尿病慢性并發癥或治療選擇的標志。此外,Klotho基因多態性與健康衰老有關。2019年,Zhu等[8]研究表明,Klotho G-395 A多態性與尿石癥和心血管疾病有關,Klotho F352 V多態性與癌癥和長壽有關,F等位基因在決定人類壽命方面起著保護作用。由此可見,KL基因的多態性同樣可能與腦梗死的發生具有密切的關系。

關于SCARB1基因和KL基因的基因多態性與糖尿病合并腦梗死易感性之間關系的臨床數據分析尚未見于中國山西漢族人群。本研究旨在探討腦梗死患者SCARB1基因rs5888位點,以及KL基因rs1207568位點單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNP)與未患有腦梗死或糖尿病對照者之間的關系,揭示SCARB1基因與KL基因的基因多態性與漢族人群糖尿病合并腦梗死易感性的關系。在山西省,本研究可能為糖尿病合并腦梗死易感性篩查和預防性干預提供可用的遺傳易感性標記,這將有利于未來開展糖尿病和腦梗死的預測性篩查,有助于早期發現糖尿病和腦梗死的潛在致病基因并進行預防性干預。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析工具

基于NCBI,Protscale,SignalP,TMHMM,PSORT,ProtParam和SecretomeP數據庫或軟件,對SCARB1和klotho基因的結構、理化性質、表達和分布進行基本的預測分析。表1中顯示了所使用的軟件URL(Uniform Resource Locator,統一資源定位器,網絡地址)。

表1 本研究使用的生物信息學軟件或數據庫及其URL

1.2 患病及對照受試者的基本特征

2019年1月至2019年6月,收集在山西心血管醫院的腦梗死合并2型糖尿病的臨床病例,所有病例均符合1995年第四屆全國腦血管會議修訂的腦梗死診斷標準。總共從山西省選出了173例漢族人群參加研究,49例腦梗死合并糖尿病患者、52例腦梗死患者和39例糖尿病患者為研究對象,33例無腦梗死或糖尿病患者為對照組,研究獲得受試者的知情同意和本院倫理委員會的批準。抽取所有患病及對照受試者的外周血,每位受試者5 ml。血樣分別測量并記錄其HDL-C、LDL-C、尿酸、同型半胱氨酸等臨床相關指標,同時進行基因特異性擴增和二代基因測序法進行測序,獲得基因單核苷酸多態性(SNP)信息,并對結果進行統計學分析。

1.3 DNA的提取

對所有病例和對照人群的外周血樣,使用DNA血液試劑盒從外周有核血細胞中分離出DNA。將提取出的DNA保存在4 ℃下備用,隨后分析所有患病及對照受試者的SCARB1基因和Klotho基因的SNP。

1.4 rs5888和rs1207568位點基因分型檢測

采用聚合酶鏈式反應突變擴增系統(polymerase chain reaction amplification refractory mutation system,ARMS-PCR)分析SCARB1的rs5888和Klotho的rs1207568位點序列,設計原則是在PCR產物中加入SNP突變位點,并保證引物的上下端之間有一定的距離。使用DNA Clean&Concentrator TM-5(ZYMO RESEARCH,目錄號D4013)試劑盒純化DNA樣品進行純化。通過紫外測量和電泳測試所制備樣品合格。DNA的定量信息使用Nano Drop UV分光光度計測定的紫外吸光度值表示,樣品的A260/A280在1.8-2.1之間。用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測,篩選合格樣品。

1.5 統計學分析

使用SPSS 21.0(美國伊利諾伊州芝加哥SPSS公司)統計軟件進行統計分析。基線數據表示為均值±標準差。基因型頻率定義為攜帶突變等位基因的受試者的百分比。等位基因頻率定義為在群體中檢測到的突變等位基因的百分比。使用卡方檢驗分析疾病關聯,兩組間計量資料的比較用獨立樣本t檢驗,當P<0.05時被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SCARB1和Klotho的生物信息學分析結果

2.1.1 SCARB1基因總體預測結果 SCARB1基因位于人類第12號染色體,位置為12q24.31,共含有15個外顯子。SCARB1基因所編碼的蛋白由481個氨基酸組成,其分子式為C2452H3771N617O683S32,分子量為53 847.56。組成SCARB1蛋白的氨基酸中,負電荷殘基總數(Asp+Glu)為41,正電荷殘基總數(Arg+Lys)為43。經ProtParam軟件預測,該蛋白的理論等電點為7.97,屬于弱堿性蛋白。SCARB1蛋白的理論消光系數由ProtParam提供,消光系數以(mol/L)-1·cm-1為單位,在水溶液中波長280 nm處測量。當假設所有Cys殘基都形成胱氨酸時,Abs 0.1%(=1 g/L)為1.269;當假設所有Cys殘基都消除時,Abs 0.1%(=1 g/L)為1.260。ProtParam軟件還對SCARB1蛋白的半衰期、穩定性、脂肪系數、親疏水性等基本性質做出了預測。預測結果顯示,SCARB1蛋白氨基酸序列的N端氨基酸為甲硫氨酸,其在哺乳動物網織紅細胞中的半衰期可達30 h。SCARB1的計算失穩指數(II)為34.00,被ProtParam軟件判定為穩定蛋白。該蛋白的脂肪指數為82.47,親水性(GRAVY)總平均值為-0.004。

2.1.2 SCARB1蛋白親疏水性預測結果 Protscale軟件對SCARB1蛋白更為詳細的親疏水性預測結果見圖1,其中,最低點位于第453號的絲氨酸殘基,得分為-2.733,最高點位于第27位的纈氨酸殘基和第28位的甲硫氨酸殘基,得分均為2.900。軟件分析結果認為,SCARB1蛋白應為親水性蛋白。

圖1 SCARB1蛋白的親疏水性預測結果Figure 1 The prediction results of the hydrophilicity and hydrophobicity of SCARB1 protein

2.1.3 SCARB1信號肽結構的分析結果 SignalP 4.0 Server對SCARB1信號肽結構的分析結果見圖2。在這項預測中,SCARB1蛋白的氨基酸序列第26位處C值達到最大,為0.273;第9位氨基酸處Y值達到最大,為0.228;S值的最大值位于第6位氨基酸處,得分0.544,平均值(1-8位)為0.893。按照軟件預測結果,SCARB1蛋白是不存在信號肽結構的。SecretomeP 2.0 Server對SCARB1蛋白的非經典蛋白質分泌做出了預測,該蛋白的SecP得分(NN-得分)為0.408 960,未超過哺乳動物推薦閾值0.6,因此SCARB1蛋白不是非經典分泌蛋白。

圖2 SCARB1信號肽結構的分析結果Figure 2 Analysis results of SCARB1 signal peptide structure

2.1.4 SCARB1蛋白的跨膜結構預測結果 SCARB1蛋白的跨膜結構由TMHMM Server v. 2.0預測,結果見圖3,該蛋白在第13-35位氨基酸處存在一個跨膜結構,第1-12位氨基酸位于膜內,第36-481位氨基酸位于膜外。

圖3 SCARB1蛋白的跨膜結構Figure 3 Transmembrane structure of SCARB1 protein

2.1.5 SCARB1組織表達特異性結果 NCBI的Nucleotide數據庫為確定所有蛋白質編碼基因的組織特異性,對代表27種不同組織的95個人類組織樣本進行了RNA-seq。統計結果顯示(見圖4),SCARB1在腎上腺中的表達最為廣泛,其RPKM(reads per kilobase per million mapped reads,每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數)為333.624±44.562,在胰腺中的表達最少,其RPKM為0.875±0.013。

圖4 SCARB1在組織中的表達情況Figure 4 SCARB1 expression in the tissues

2.1.6 SCARB1蛋白的亞細胞定位預測結果 PSORT Ⅱ對SCARB1蛋白的亞細胞定位預測結果如下,EDN1蛋白主要位于過氧化物酶體中(占33.30%),線粒體中占22.20%,細胞質中占22.20%,細胞核中占22.20%。

2.1.7 klotho基因總體預測結果 klotho基因位于人類第13號染色體,位置為13q13.1,共含有6個外顯子。klotho基因所編碼的蛋白由1 012個氨基酸組成,其分子式為C5337H8024N1410O1452S30,分子量為116 132.80。組成Klotho蛋白的氨基酸中,負電荷殘基總數(Asp+Glu)為102,正電荷殘基總數(Arg+Lys)為105。經ProtParam軟件預測,該蛋白的理論等電點為8.06,屬于堿性蛋白。當假設所有Cys殘基都形成胱氨酸時,Klotho蛋白的理論消光系數Abs 0.1%(=1 g/L)為2.056;當假設所有Cys殘基都消除時,Abs 0.1%(=1 g/L)為2.049。Klotho蛋白氨基酸序列的N端氨基酸為甲硫氨酸,它在哺乳動物網織紅細胞中的半衰期為30 h。Klotho的計算失穩指數(II)為41.72,被ProtParam軟件判定為不穩定蛋白。該蛋白的脂肪指數為83.69,親水性總平均值為-0.264。

2.1.8 Klotho蛋白親疏水性預測結果 Protscale軟件對Klotho蛋白的親疏水性預測結果見圖5,其中,最低點位于第1 008位的精氨酸殘基,得分為-2.667,最高點位于第986位的異亮氨酸殘基,得分為3.100。從圖中可以看出,Klotho蛋白的氨基酸殘基大多位于零點以下的負值親水區域,因此該蛋白應為親水性蛋白。該結論與ProtParam預測到的結論相同,互為印證,可信度較高。

圖5 Klotho蛋白的親疏水性預測結果Figure 5 The prediction results of the hydrophilicity and hydrophobicity of Klotho protein

2.1.9 klotho信號肽結構的分析結果 SignalP 4.1 Server對klotho信號肽結構的分析結果見圖6。在這項預測中,Klotho蛋白的氨基酸序列第34位處C值與Y值達到最大,分別為0.494和0.594,S值的最大值位于第7位,為0.893,S值平均值(1-33位)為0.669。因此,按照判定標準,Klotho蛋白是可能存在信號肽結構的。

圖6 klotho信號肽結構的分析結果Figure 6 Analysis results of klotho signal peptide structure

2.1.10 Klotho蛋白的跨膜結構預測結果 Klotho蛋白的跨膜結構預測結果見圖7,該蛋白在第982-1004位處存在一個跨膜結構,第1-981位位于膜內,第1005-1012位位于膜外。

圖7 Klotho蛋白的跨膜結構Figure 7 Transmembrane structure of Klotho protein

2.1.11 klotho組織表達特異性結果 NCBI對klotho進行RNA-seq分析后的統計結果顯示,klotho在腎臟中的表達最為廣泛,其RPKM為80.634±30.462,在骨髓中的表達最少,其RPKM為0.05±0.045(見圖8)。

圖8 klotho在組織中的表達情況Figure 8 Klotho's expression in the tissues

2.1.12 Klotho蛋白的亞細胞定位預測結果 PSORT Ⅱ對Klotho蛋白的亞細胞定位預測結果如下,Klotho蛋白主要位于內質網中(占44.40%),其他部位如高爾基體中占33.30%,質膜中占22.20%。

2.2 患病及對照受試者的基本特征

患者和對照之間的年齡和性別沒有顯著差異(P>0.05,見表2)。各組研究對象的基本特征見表2。

表2 患病及對照受試者的基本特征

2.3 SCARB1基因rs5888及Klotho基因rs1207568的位點分析

SCARB1基因rs5888為同義替換,轉錄本雖然出現改變,但原丙氨酸密碼子在突變并經翻譯后,該位點仍為丙氨酸。圖9所示的三維模型(Swiss-PdbViewer 4.1.0軟件制作)展示了該突變位點的具體位置,圖中紫色蛋白為突變后被替換的丙氨酸,表中表示的是SCARB1蛋白三級結構的具體信息。

Rs5888Amino acid residueBondsAnglesTorsionImproperHonbondedElectrostaticConstraintTotalAALA3502.7153.6011.6660.082-23.040.320.000 0E=-14.658

klotho基因rs1207568突變屬于上游轉錄本變體,并未對該基因所編碼蛋白的氨基酸序列造成影響,且尚未在ClinVar中有過具體臨床意義的記錄。圖10中紫色框內所顯示的序列即為rs1207568突變位點(數據獲取自美國NCBI的SNP數據庫)。

圖10 klotho基因rs1207568位點信息Figure 10 Information of klotho gene rs1207568 locus

2.4 SCARB1基因rs5888及Klotho基因rs1207568的基因型和等位基因頻率及與臨床參數的關系

首先分別在SCARB1 rs5888和Klotho rs1207568的患者或對照組中對臨床參數進行比較分析,結果見表3-10。經過對不同基因型受試者在凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、國際標準化比值(INR)、總膽固醇標準值(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、尿酸(UA)、同型半胱氨酸(HCY)、血糖(BS)、糖化血紅蛋白(HbA1C)等臨床參數上的統計結果進行分析,認為受試者的基因型分布沒有明顯偏離Hardy-Weinberg平衡。測序證實SCARB1基因和klotho基因分別在rs5888和rs1207568具有基因多態性。

從表3可以看到,腦梗死合并糖尿病組除UA在Klotho rs1207568不同基因型之間差異有統計學意義(P<0.05)外,其他臨床參數PT、APTT、INR、CHO、TG、HDL-C、LDL-C、HCY、BS和HbA1C在不同基因型之間差異均無統計學意義(P>0.05)。由于CC組的例數相對比較多,CT和TT組的例數比較少,為減少統計學誤差,將CT基因型和TT基因型合并為一組,進行分析。

表3 腦梗死合并糖尿病組Klotho rs1207568基因型臨床參數比較

腦梗死合并糖尿病組所有臨床參數在SCARB1 rs5888不同基因型之間差異均無統計學意義(P>0.05,見表4)。

表4 腦梗死合并糖尿病組SCARB1 rs5888基因型臨床參數比較

單純性腦梗死組所有臨床參數在Klotho rs1207568不同基因型之間差異均無統計學意義(P>0.05,見表5)。

表5 單純性腦梗死組Klotho rs1207568基因型臨床參數比較

單純性腦梗死組所有臨床參數在SCARB1 rs5888不同基因型之間差異均無統計學意義(P>0.05,見表6)。

表6 單純性腦梗死組SCARB1 rs5888基因型臨床參數比較

單純性糖尿病組TG在Klotho rs1207568不同基因型之間差異有統計學意義(P<0.05),其他臨床參數不同基因型之間差異均無統計學意義(P>0.05,見表7)。

表7 單純性糖尿病組Klotho rs1207568基因型臨床參數比較

單純性糖尿病組APTT在SCARB1 rs5888不同基因型之間差異有統計學意義(P<0.05),其他臨床參數不同基因型之間差異無統計學意義(P>0.05,見表8)。

表8 單純性糖尿病組SCARB1 rs5888基因型臨床參數比較

對照組所有臨床參數Klotho rs1207568不同基因型之間差異均無統計學意義(P>0.05,見表9);所有臨床參數SCARB1 rs5888不同基因型之間差異均無統計學意義(P>0.05,見表10)。

表9 對照組Klotho rs1207568基因型臨床參數比較

表10 對照組SCARB1 rs5888基因型臨床參數比較

山西省漢族173例SCARB1基因rs5888多態性的基因型和等位基因頻率結果顯示:腦梗死合并糖尿病患者組SCARB1 rs5888的CT/TT頻率明顯高于正常對照組,但CC頻率低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05,見表11)。

表11 不同組患者SCARB1基因rs5888基因多態性比較 [例(%)]

山西省漢族人群Klotho基因rs1207568多態性的173例基因型和等位基因頻率結果顯示,各組間在Klotho rs1207568中的CT/TT和CC頻率差異無統計學意義(P>0.05,見表12)。

表12 不同組患者Klotho基因rs1207568基因多態性比較 [例(%)]

3 討論

本研究首先通過生物信息學的手段對人SCARB1及klotho基因及蛋白的相關結構和性質進行了系統的分析。研究發現,SCARB1蛋白為親水性堿性蛋白,該結論與ProtParam預測到的結論相同,互為印證,可信度較高。SCARB1蛋白不存在信號肽結構,不是非經典分泌蛋白,該蛋白存在一個跨膜結構,主要表達于腎上腺中,并主要定位于過氧化物酶體。Klotho蛋白為親水性堿性蛋白,可能存在信號肽結構,存在一個跨膜結構,在腎臟中的表達最為廣泛,并主要定位于內質網中,預測結果與文獻報道基本一致。

先前的研究發現SCARB1多態性與脂質代謝有關[9]。對SCARB1 SNP rs5888 C/T基因型的分析顯示,在對照組中,TT基因型攜帶者中老年男性和年輕女性的血脂譜具有動脈粥樣硬化保護表型[10]。同時,大量研究表明,人klotho基因多態性與血管疾病有關,可能是一個潛在的調控位點[11]。由于rs1207568存在于該基因的啟動子區,不影響蛋白質的氨基酸序列,可能影響klotho基因的轉錄活性,從而影響klotho基因的表達,導致血管修復能力弱,導致疾病的發生。

本研究中測序結果表明SCARB1基因及klotho基因分別存在rs5888及rs1207568位點上的基因多態性。我們的研究表明,Klotho rs1207568不同基因型間臨床參數比較,除腦梗死合并糖尿病組UA和單純性糖尿病組TG有顯著差異(P<0.05)外,其他臨床參數均沒有顯著差異(P>0.05)。SCARB1 rs5888不同基因型間臨床參數比較,除單純性糖尿病組APTT有顯著差異(P<0.05)外,其他臨床參數均沒有顯著差異(P>0.05)。腦梗死合并糖尿病患者SCARB1 rs5888的CT/TT頻率明顯高于正常對照,但CC頻率低于正常對照(P<0.05)。各組間在Klotho rs1207568中的CT/TT和CC頻率差異不顯著(P>0.05)。本研究表明SCARB1基因rs5888多態性與人類對糖尿病合并腦梗死的易感性密切相關,并且可能是對其進行評估的重要分子標志物。

另一方面,我們注意到,rs5888多態性導致的編碼氨基酸雖然沒有改變,仍然是編碼丙氨酸,因此推測該多態性的生物學意義也可能通過涉及剪接調控系統的機制起到功能性作用。從這個角度來看,值得注意的是,與純合CC或TT相比,雜合子個體中SCARB1 mRNA表達明顯降低,因此該位點的基因多態性還是可以提供一個主要的基因表達負調控效應[12]。進一步的研究有望對這個有趣的問題提供更深刻的見解。

動脈粥樣硬化是糖尿病的慢性并發癥之一,也是腦梗死的主要致病因素,近年來,隨著糖尿病發病率的不斷上升,糖尿病相關并發癥也成為了糖尿病患者致殘、致死的主要因素[13],而合并糖尿病的腦梗死越發引起人們的重視[2]。本課題對klotho基因啟動子區rs1207568多態性,以及SCARB1 rs5888單核苷酸多態性與合并2型糖尿病的腦梗死相關性的探索,是對研究相關疾病發病機制和診治方法進行的一次探索,為該領域更進一步的研究提供一定的基礎。