小檗胺對糖尿病心肌病心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

董文婷,尚福軍,郭 錦,劉治國,劉 慧,劉艷麗*

(1西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院心臟內(nèi)科,西安 710100;2臨汾經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)新立醫(yī)院內(nèi)科;3空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:yanliliugjyxzx@126.com)

糖尿病是一種以長期高血糖為特征的慢性內(nèi)分泌代謝綜合疾病,嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。糖尿病患者晚期往往會存在異常的心肌結(jié)構(gòu)和功能改變,即出現(xiàn)糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)[2]。這些改變以心肌纖維化、病理重塑和心功能障礙為特征,且不受冠狀動脈疾病、瓣膜病、高血壓和血脂異常等常規(guī)心血管危險(xiǎn)因素的影響[3,4]。目前尚沒有一種臨床治療方法可以緩解這種特定形式的心臟病,因此亟待探索有效的藥物和分子靶點(diǎn)來控制糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。

小檗胺(berbamine,BBM)是存在于小檗屬植物中的一種雙芐基異喹啉類生物堿,具有抗癌、抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)作用[5,6]。近年來研究發(fā)現(xiàn),小檗胺在心血管系統(tǒng)及其相關(guān)疾病方面都發(fā)揮了重要的保護(hù)作用[7]。然而小檗胺能否抵抗糖尿病心肌病心肌損傷并延緩其發(fā)生發(fā)展尚無研究報(bào)道。因此,本研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)聯(lián)合高糖脂飲食法建立小鼠糖尿病心肌病模型,以觀察小檗胺對糖尿病心肌病的保護(hù)作用并探討其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑

清潔級雄性C57BL/6小鼠60只,8周齡,飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境中,購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。使用許可證號:SYXK(軍)2012-0022。小檗胺(BBM,貨號:547190)和鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,貨號:S0130)購自美國Sigma公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,貨號:A001-3-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px,貨號:A005-1-2)和丙二醛(malondialdehyde,MDA,貨號:A003-1-2)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。SIRT3(貨號:ab246522)、gp91phox(貨號:ab129068)、Collagen-1(貨號:ab260043)和β-actin(貨號:ab8226)抗體購自美國Abcam公司。Ac-FOXO3a(貨號:#9441)和FOXO3a(貨號:#2497)抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物模型建立及分組處理 將60只小鼠隨機(jī)分為以下4組:正常對照組(control組)、單純藥物處理正常對照組(Con+BBM組)、糖尿病心肌病組(DCM組)和DCM+BBM組(糖尿病心肌病+藥物處理組),每組15只。糖尿病心肌病模型建立方法如下:出生8周的C57BL/6雄性小鼠,連續(xù)3 d腹腔注射STZ,60 mg/(kg·d),每次腹腔注射前禁食12 h;2周后,禁食8 h,測量空腹血糖,血糖值≥11.1 mmol/L為糖尿病造模成功;已成糖尿病的小鼠,繼續(xù)給予高熱量飼料喂養(yǎng)12周,構(gòu)成糖尿病心肌病模型。

control組和DCM組灌胃生理鹽水,Con+BBM組灌胃BBM(100 mg/kg),DCM+BBM組小鼠在STZ注射2周后,每天通過灌胃補(bǔ)充小檗胺處理(100 mg/kg)共12周。實(shí)驗(yàn)所需的BBM及STZ劑量參考文獻(xiàn)[8,9]。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用小動物超聲儀檢測小鼠心臟收縮功能;HE染色法觀察小鼠左心室心肌細(xì)胞橫截面積;計(jì)算各組小鼠HMI和LVMI;Masson染色法觀察心肌組織纖維化程度;免疫組化染色法檢測心肌組織Collagen-1表達(dá)程度;分光光度法檢測心肌組織中SOD、GSH-Px和MDA的含量;RT-PCR法檢測心肌肥厚相關(guān)基因α-MHC和β-MHC的表達(dá)水平;Western blot法檢測SIRT3、Ac-FOXO3a和gp91phox的蛋白表達(dá)水平。

1.2.2 心功能測定 小鼠行心臟超聲檢測前一天,胸部脫毛,異氟烷吸入麻醉。置于恒溫檢測臺上,當(dāng)心率維持在400-500次/min,調(diào)整超聲探頭,利用VisualSonics Vevo 2100高分辨率小動物超聲系統(tǒng)和專用于小鼠的RMV 707B高頻探頭,進(jìn)行M型超聲檢測。檢測左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection,LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.2.3 心肌肥厚指數(shù)HMI和LVMI測定 小鼠稱重后處死,立即取下心臟及右下肢脛骨,分別測量心臟的全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量以及脛骨長度,心肌肥厚指數(shù)HMI(heart mass index)和LVMI(left ventricular mass index)以全心質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/g)及左心室質(zhì)量/體質(zhì)量比(mg/g)計(jì)算。

1.2.4 心臟組織學(xué)染色 小鼠心臟取材后制備成石蠟切片,用蘇木精-伊紅(HE)染色以觀察心肌細(xì)胞橫截面積,用Masson染色以觀察心肌組織纖維化情況。將石蠟切片與含有5% BSA的Collagen-1一抗孵育行免疫組化染色,以檢測心肌組織膠原蛋白表達(dá)程度。

1.2.5 SOD、GSH-Px和MDA含量測定 心肌組織中抗氧化物SOD、GSH-Px和脂質(zhì)過氧化物MDA的含量基于試劑盒要求測定,并檢測吸光度值,分光光度法分析數(shù)據(jù)。

1.2.6 RT-PCR法檢測α-MHC和β-MHC基因表達(dá)水平 RT-PCR法檢測心肌肥厚相關(guān)基因α-MHC和β-MHC表達(dá)。用TRIzol試劑從組織中分離總RNA,對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA,用分光光度法測定RNA和cDNA的濃度和純度。引物采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì),由上海吉凱基因有限公司合成。在iQTM5 RT-PCR系統(tǒng)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用2-ΔΔCt法對靶基因表達(dá)量進(jìn)行相對定量。引物序列見表1。

表1 心肌肥厚基因α-MHC和β-MHC引物序列

1.2.7 Western Blot法檢測SIRT3、Ac-FOXO3a、FOXO3a和gp91phox蛋白表達(dá)水平 取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在37 ℃下封閉膜2 h,用特異性SIRT3(1 ∶1 000)、Ac-FOXO3a(1 ∶500)、FOXO3a(1 ∶500)和gp91phox(1 ∶1 000)一抗孵育24 h。然后用相應(yīng)的酶標(biāo)二抗在37 ℃下孵育膜1 h。用ECL發(fā)光液并通過Bio-Rad系統(tǒng)成像,觀察膜上的蛋白條帶。以β-actin作為內(nèi)參,檢測各蛋白的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)采用Prism 5.0軟件進(jìn)行分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小檗胺顯著改善糖尿病心肌病小鼠心臟功能損傷

超聲檢測結(jié)果顯示,與control組相比,DCM組小鼠的心臟收縮功能顯著下降,表現(xiàn)為LVEF和LVFS值明顯降低(P<0.05),給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組小鼠的心臟收縮功能顯著提高(P<0.05);Con+BBM組小鼠的LVEF與LVFS值與control組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖1)。

2.2 小檗胺顯著改善糖尿病心肌病小鼠心肌肥厚程度

組織學(xué)檢測指標(biāo)顯示,與control組相比,DCM組小鼠的HMI和LVMI顯著升高(P<0.05);給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組小鼠的HMI和LVMI值顯著降低(P<0.05)。HE染色顯示,與control組相比,DCM組小鼠的心肌細(xì)胞橫截面積顯著增大(P<0.05);給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組小鼠的心肌細(xì)胞橫截面積顯著縮小(P<0.05,見圖2,3)。心肌肥厚相關(guān)基因檢測顯示,與control組相比,DCM組小鼠心肌組織α-MHC表達(dá)明顯下調(diào),β-MHC的顯著表達(dá)上調(diào)(P<0.05);給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組小鼠心肌組織α-MHC/β-MHC的比例被顯著逆轉(zhuǎn)(P<0.05,見圖2,3)。Con+BBM組小鼠的HMI和LVMI值、心肌細(xì)胞橫截面積及α-MHC/β-MHC的比例與control組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖2,3)。

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與DCM組相比,##P<0.01圖1 各組小鼠心臟超聲檢測結(jié)果比較Figure 1 Comparison of ultrasonic parameter between groups

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與DCM組相比,##P<0.01圖2 各組小鼠心肌肥厚指標(biāo)比較Figure 2 Comparison of indexes of cardiac hypertrophy between groups

圖3 各組小鼠心肌細(xì)胞平均橫截面積比較 (HE染色)Figure 3 Comparison of mean cross-sectional area of cardiomyocyte between groups (HE staining)

2.3 小檗胺顯著減輕糖尿病心肌病小鼠心肌纖維化程度

Masson及Collagen-1染色顯示,與control組相比,DCM組小鼠的膠原纖維含量顯著增加,心肌纖維化程度顯著升高(P<0.05),給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組膠原纖維含量顯著降低,小鼠心肌纖維化進(jìn)展被明顯抑制(P<0.05);Con+BBM組小鼠的心肌纖維化程度與control組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖4)。

與control組相比,**P<0.01;與DCM組相比,##P<0.01圖4 各組小鼠心肌纖維化程度比較Figure 4 Comparison of the degree of myocardial fibrosis between groups

2.4 小檗胺顯著減輕糖尿病心肌病小鼠心肌組織氧化應(yīng)激損傷

與control組相比,DCM組小鼠心肌組織中抗氧化物SOD及GSH-Px活性顯著降低,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著升高,并且氧化應(yīng)激標(biāo)志蛋白gp91phox表達(dá)顯著上升(P<0.05),給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組小鼠抗氧化物質(zhì)顯著上升,心肌組織的氧化應(yīng)激水平明顯下降(P<0.05);Con+BBM組小鼠上述心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)與control組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖5)。

2.5 小檗胺顯著上調(diào)糖尿病心肌病小鼠心肌組織SIRT3信號表達(dá)

與control組比較,DCM組小鼠心肌組織SIRT3蛋白表達(dá)水平及去乙?；钚跃黠@下調(diào),FOXO3a乙?；潭蕊@著上升(P<0.05),給予小檗胺處理后,與DCM組相比,DCM+BBM組小鼠心肌組織SIRT3蛋白表達(dá)水平及去乙?；钚跃黠@上調(diào),FOXO3a乙?；潭蕊@著下降(P<0.05);Con+BBM組小鼠心肌組織SIRT3通路表達(dá)與control組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖6)。

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與DCM組相比,#P<0.05,##P<0.01圖5 各組小鼠心肌氧化應(yīng)激水平比較Figure 5 Comparison of myocardial oxidative stress level between groups

3 討論

糖尿病發(fā)病率逐年攀升,已成為威脅世界健康的最常見疾病之一[10]。臨床研究發(fā)現(xiàn),糖尿病心肌病是由長期高血糖狀態(tài)發(fā)展導(dǎo)致的心肌細(xì)胞代謝紊亂和心臟微血管病變,繼而引起心臟結(jié)構(gòu)和功能異常,并最終導(dǎo)致心絞痛、心力衰竭和心律失常等不良事件的發(fā)生,嚴(yán)重影響了糖尿病患者的預(yù)后[11]。考慮到傳統(tǒng)的抗糖尿病藥物不能完全預(yù)防這一心血管并發(fā)癥的發(fā)生和進(jìn)展,因此亟需尋找一種針對糖尿病心肌病病理生理改變的新的治療藥物。

近年來,天然植物提取物已被廣泛應(yīng)用于包括糖尿病在內(nèi)的多種疾病的治療或輔助治療中。一種從伏?；ㄖ参镏刑崛〉男》肿踊衔镄￠薨繁话l(fā)現(xiàn)對糖尿病及其相關(guān)器官損害均表現(xiàn)出了保護(hù)作用[12-14],并且大量文獻(xiàn)也報(bào)道小檗胺可以減輕多種致病因素導(dǎo)致的心肌損傷[15-17]。然而,其能否同樣緩解糖尿病心肌病心肌損傷有待進(jìn)一步探究。糖尿病心肌病終末階段可以表現(xiàn)出明顯的心臟收縮功能障礙,且一般被認(rèn)為是不可逆損傷。我們的研究首先發(fā)現(xiàn),與control組相比,DCM組小鼠的心臟收縮功能顯著下降,表現(xiàn)為LVEF和LVFS值明顯降低,而給予小檗胺處理后,可以顯著提高糖尿病心肌病小鼠心臟收縮功能。以上結(jié)果提示,小檗胺對于糖尿病心肌病心肌損傷具有潛在的緩解作用。

心肌肥厚和心肌纖維化是糖尿病心肌病心肌重塑的特征性病理改變。長期慢性損傷加之負(fù)荷過重導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大,進(jìn)而引起左心室重量增加及左心室壁增厚[18]。在外部環(huán)境因素的刺激下,心肌細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積和膠原纖維含量增加共同促進(jìn)了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展,最終參與心臟結(jié)構(gòu)和功能的破壞[19]。本研究結(jié)果顯示,給予小檗胺處理能夠顯著緩解糖尿病心肌病小鼠心肌細(xì)胞肥大和左室質(zhì)量增加,并能明顯抑制心肌膠原纖維沉積,提示小檗胺能夠顯著抑制糖尿病心肌肥厚和心肌纖維化進(jìn)展。肌凝蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)是肌凝蛋白的基本單位,在保證肌細(xì)胞正常功能中起著重要作用。肌球蛋白重鏈的兩種異構(gòu)體α-MHC和β-MHC在肥厚的心臟中發(fā)生典型的MHC變化,即由α-MHC變?yōu)棣?MHC[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí),小檗胺處理能夠顯著上調(diào)糖尿病心肌組織α-MHC的基因表達(dá),并明顯下調(diào)β-MHC基因的表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證了小檗胺逆轉(zhuǎn)糖尿病心肌肥厚的作用。

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與DCM組相比,##P<0.01圖6 各組小鼠心肌組織SIRT3/FOXO3a通路表達(dá)比較Figure 6 Comparison of protein expression of cardiac SIRT3/FOXO3a signaling between groups

以往研究證實(shí),心肌組織氧化應(yīng)激損傷是糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[21]。與糖尿病相關(guān)的代謝環(huán)境,如高血糖、高脂血癥和高胰島素血癥,會直接導(dǎo)致線粒體和非線粒體來源的ROS生成增加[22]。過度刺激產(chǎn)生的ROS會進(jìn)一步引發(fā)內(nèi)源性抗氧化物的耗竭以及促氧化損傷產(chǎn)物的積累[9]。同時(shí),糖尿病心肌纖維化和心肌肥厚也與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。一方面,ROS過量產(chǎn)生可誘導(dǎo)TGF-β1/Smad3信號激活,促進(jìn)多種纖維化標(biāo)志物的表達(dá),導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成[23]。另一方面,氧化應(yīng)激損傷可導(dǎo)致肌凝蛋白重鏈由α-MHC亞型向β-MHC亞型轉(zhuǎn)換,標(biāo)志著心肌肥厚的進(jìn)展[24]。因此,減輕心肌組織氧化應(yīng)激損傷將是治療糖尿病心肌病的一個(gè)重要策略。小檗胺前期被證實(shí)具有廣泛的心血管藥理作用,且因其高效的抗氧化活性在多種致病因素導(dǎo)致的心肌損傷中表現(xiàn)出了保護(hù)效應(yīng)[7,16,25]。本研究發(fā)現(xiàn),給予小檗胺處理后,糖尿病小鼠心肌組織抗氧化物SOD及GSH-Px活性顯著上升,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著降低,并且氧化應(yīng)激標(biāo)志蛋白gp91phox表達(dá)顯著下降,有效抑制了心肌組織的氧化應(yīng)激水平,提示小檗胺同樣能夠通過發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用,減輕糖尿病心肌損傷。

沉默信息調(diào)控因子3(silent information regulator 3,SIRT3)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；?主要定位于線粒體。因其對線粒體相關(guān)酶的去乙?；饔?可通過對能量代謝、氧化應(yīng)激等的調(diào)節(jié),在心臟領(lǐng)域扮演重要角色[26]。既往研究表明,以SIRT3分子為靶點(diǎn),上調(diào)SIRT3的表達(dá)在心肌損傷保護(hù)方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用[27]。作為SIRT3下游調(diào)控分子,FOXO3a去乙?；竽艽龠M(jìn)過氧化氫酶和超氧化物歧化酶基因轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而增強(qiáng)心肌細(xì)胞對氧化應(yīng)激損傷的抵抗作用[28]。然而SIRT3/FOXO3a通路能否介導(dǎo)小檗胺減輕糖尿病心肌病心肌損傷仍有待于進(jìn)一步探究。本研究結(jié)果顯示,與control組相比,DCM組小鼠心肌組織SIRT3的表達(dá)及去乙?；钚燥@著下調(diào),Ac-FOXO3a表達(dá)明顯上升;給予小檗胺處理能夠顯著激活SIRT3的表達(dá)并增強(qiáng)其去乙酰化活性,同時(shí)抑制Ac-FOXO3a的表達(dá),提示小檗胺可能通過激活心肌細(xì)胞內(nèi)SIRT3/FOXO3a通路降低氧化應(yīng)激水平,繼而減輕糖尿病心肌病心肌細(xì)胞的損傷。

綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)小檗胺具有顯著的抗糖尿病心肌病心肌損傷的作用,能夠有效抑制心肌氧化應(yīng)激損傷、減緩心肌重構(gòu)并改善小鼠心臟功能惡化,其分子機(jī)制可能與激活心肌SIRT3/FOXO3a信號有關(guān)。我們的研究為臨床上應(yīng)用小檗胺減輕糖尿病心肌病患者的心臟損傷提供了新的理論依據(jù)。