多巴胺1類受體活化減輕心力衰竭早期炎癥反應的實驗研究

武栗妃,馬友才,王 霞,闞曉玉

(1山西醫科大學病理生理教研室,太原 030001;2首都醫科大學附屬北京安貞醫院急診科;3首都醫科大學病理生理教研室;4首都醫科大學附屬北京安貞醫院血液科;*通訊作者,E-mail:wifi04151127@163.com)

心力衰竭是各種心血管疾病的終末階段,發病率和病死率極高。炎癥反應在心力衰竭的發生發展中具有重要的作用[1-3]。炎癥因子的水平與心力衰竭的不良預后具有明顯的相關性[1-4]。多巴胺及多巴胺受體除了在神經系統疾病中發揮作用,在心血管系統中也具有重要的作用,臨床上多巴胺多用于急性心力衰竭的治療[5]。多巴胺通常作用于多巴胺受體(DR)發揮作用,包括D1和D2類受體。D1類受體由D1R和D5R組成,活化后可激活腺苷酸環化酶的活性;D2類受體由D2R、D3R和D4R,活化后抑制腺苷酸環化酶的活性[6,7]。以往研究發現多巴胺通過作用于多巴胺1類受體抑制系統性炎癥反應在膿毒癥中發揮保護作用[8]。此外,多巴胺1類受體可以調節免疫細胞的功能在自身免疫性疾病中具有重要作用[9]。然而多巴胺1類受體是否調控炎癥反應進而參與心力衰竭的發病過程目前尚不清楚。本研究通過橫向主動脈弓縮窄術(transverse aortic constriction,TAC)建立心力衰竭的模型,觀察給予多巴胺1類受體的激動劑非諾多泮對心力衰竭早期炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組 為了觀察多巴胺受體在心力衰竭小鼠心臟中表達的變化,健康雄性清潔級C57BL/6J小鼠20只,8周齡,體質量20-22 g,購自北京斯貝福實驗動物科技有限公司。隨機分為兩組:①假手術組:開胸不做橫向主動脈弓縮窄術,喂養6周;②TAC組:TAC術后喂養6周。為觀察多巴胺受體5激動劑非諾多泮對TAC早期心臟炎癥反應的影響,健康雄性C57BL/6J小鼠40只,按隨機數字表隨機分為以下4組:①假手術聯合磷酸鹽緩沖溶液(PBS)組:開胸不做橫向主動脈弓縮窄術,手術后立即腹腔注射PBS,按10 mg/kg,每天1次,連續注射1周;②假手術聯合非諾多泮組:手術后立即腹腔注射非諾多泮,按10 mg/kg,每天1次,連續注射1周;③TAC聯合PBS組:TAC術后立即腹腔注射PBS,按10 mg/kg,每天1次,連續注射1周;④TAC聯合非諾多泮組:手術后立即腹腔注射非諾多泮,按10 mg/kg,每天1次,連續注射1周。每組10只小鼠,以上分組均為普通飲食,自由飲水飲食。

1.1.2 主要儀器與試劑 NIS-ELEMENTS定量分析軟件,ECLIPSE 90i顯微鏡(Nikon,日本),蠟塊包埋機(Leica,德國),Vivid 7小動物超聲心動儀(GE Healthcare,英國),NanoDrop spectrophotometer(Thermo Scientific,美國)。非諾多泮(Sigma,美國),D5R抗體(Santa Cruz biotechnology公司,美國),3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)購自中杉抗體公司;反轉錄試劑盒(Agilent Technologies,美國),SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 TAC模型的制備 采用橫向主動脈弓縮窄術(transverse aortic constriction,TAC)的方法,設立假手術組。具體方法為:將小鼠用1%戊巴比妥鈉將小鼠麻醉,使其仰臥位固定于手術臺,在顯微鏡下,從頸部正中線處切開皮膚暴露胸腔部位,從胸骨左上第二肋間進入胸腔,將胸腺移開視野暴露主動脈弓,在分離的頭臂干和左頸總動脈之間的橫向動脈弓平行的部位,將其用7-0絲線和27號針頭緊緊地綁在一起,然后立即去掉針頭,這樣就縮窄成直徑為0.4 mm的動脈[10]。手術后7 d,測定主動脈弓血流峰值情況,大于2 000 mm/s表明手術成功,待TAC術后1周測定心功能,之后于麻醉狀態下斷頸處死小鼠。

1.2.2 心功能測定 TAC術后1周測量小鼠心臟功能;小鼠用3%異氟烷(isofluorane)麻醉直到心率穩定在每分鐘400-500次。使用40 MHz探頭高解析度微型超聲波系統測量得到收縮期、舒張期以及左室前后壁的二維短軸圖像。射血分數(EF)和短軸縮短率(FS)分別計算使用Vevo分析軟件(版本2.2.3)。所有測試對象均采用相同技術參數,并至少測量5個連續周期,取其平均數[10,11]。

1.2.3 組織病理切片及HE(蘇木精-伊紅染液)染色 用含有肝素的0.9%氯化鈉注射液灌注心臟后剪下整個心臟浸泡于福爾馬林固定24 h,制作石蠟切片。蘇木素伊紅染色程序及結果判定參見試劑盒說明書(Solarbio公司)。采用尼康電子顯微鏡(N90i)采集圖像[12]。

1.2.4 組織病理切片及免疫組織化學染色 用含有肝素的0.9%氯化鈉注射液灌注心臟后剪下整個心臟浸泡于福爾馬林固定24 h,制作石蠟切片。采用免疫組織化學法染色觀察心臟組織炎癥細胞浸潤。免疫組織化學法的染色程序及結果判定參見試劑盒說明書(邁新公司)。采用尼康電子顯微鏡(N90i)采集圖像[12]。

1.2.5 real-time PCR法 檢測TAC術后6周心臟多巴胺受體1-5 mRNA水平及TAC術后1周心臟炎癥相關因子的mRNA表達。每組各取5只TAC術后小鼠,收取整個心臟組織,Trizol法抽提總RNA。測定RNA純度、濃度,后反轉為cDNA,進行real-time PCR[13]。反應條件為:反應溫度95 ℃ 5 min→95 ℃ 15 s→60 ℃ 45 s(45循環);熔解曲線:55 ℃→95 ℃(升高0.5 ℃/cycle,81循環)。使用軟件自行設計引物,由上海生工公司合成(見表1)。

表1 基因名稱和引物序列

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 多巴胺受體在TAC術后6周心臟中的表達

實時熒光定量PCR可見,與假手術組比較,TAC組心臟多巴胺受體1、多巴胺受體3及多巴胺受體4在心臟的表達沒有變化;多巴胺受體2水平降低,多巴胺受體5的水平升高(見圖1A)。免疫組化結果可見,與假手術組比較,TAC組多巴胺受體5在心臟的表達水平明顯升高(見圖1B)。

圖1 多巴胺受體在TAC術后6周心臟中的表達Figure 1 The expression of dopamine receptor in heart at week 6 after TAC

2.2 橫向主動脈弓成功指標評價

橫向主動脈縮窄術后1周,多普勒超聲模式下,結扎處可見彩色血流信號,血流速度增加,血流速度峰值可達2 000 mm/s以上(見圖2)。假手術組小鼠主動脈弓左頸總動脈與頭臂干之間血流速度為800 mm/s(見圖2)。

圖2 橫向主動脈術弓縮窄術后1周的超聲影像圖Figure 2 Ultrasound image at week 1 after TAC

2.3 四組術后1周心臟炎癥細胞浸潤及炎癥因子水平

與假手術+PBS組比較,TAC+PBS組術后1周心臟浸潤的炎癥細胞明顯增多;與TAC+PBS組比較,TAC+非諾多泮組心臟炎癥細胞的浸潤減少(見圖3A)。與假手術+PBS組比較,TAC+PBS組術后1周心臟炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平明顯升高(4.18±0.31vs10.14±0.99,P<0.05;3.79±0.08vs14.43±2.35,P<0.05);與TAC+PBS組比較,TAC+非諾多泮組心臟炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平明顯降低(10.14±0.99vs4.19±0.47,P<0.05;14.43±2.35vs4.36±0.72,P<0.05,見圖3B)。

2.4 四組術后1周的心功能比較

與假手術+PBS組比較,TAC+PBS組術后1周心臟射血分數與短軸縮短分數無明顯變化(P>0.05);與TAC+PBS組比較,TAC+非諾多泮組術后1周心臟射血分數和短軸縮短分數無明顯的變化(P>0.05,見圖4,表2)。

與假手術+PBS組比較,#P<0.05;與TAC+PBS組比較,*P<0.05B.實時熒光定量PCR檢測橫向主動脈弓縮窄術后1周心臟炎癥因子的水平圖3 四組小鼠術后1周心臟炎癥細胞浸潤及炎癥因子水平Figure 3 Infiltration of inflammtory cells and mRNA levels of inflammatory factors in heart at week 1 after operation in four groups

表2 四組小鼠術后1周射血分數與短軸縮短分數比較 (%)

3 討論

各種心臟疾病發展到晚期均會出現心力衰竭,持續的炎癥反應促進心力衰竭的發展進程。炎癥細胞及炎癥介質介導的炎癥反應導致心肌肥大、心肌細胞凋亡,心肌纖維化最終發生病理性心肌重塑[14]。炎癥介質水平增高與心力衰竭不良預后有關。神經系統通過釋放神經激素或神經遞質影響免疫功能[1]。目前越來越多的證據表明神經系統和神經遞質在炎癥反應中具有重要的調節作用[15]。多巴胺及其受體除了在中樞神經系統中具有重要的作用,在損傷或感染所致的系統性炎癥反應及心血管疾病中也具有重要的作用。多巴胺或受體的激動劑作用于多巴胺受體能夠調節免疫細胞的活化、增殖和細胞因子的產生。腎臟多巴胺受體具有調節血壓的作用[12,16]。有研究表明心臟特異性過表達腺苷酸環化酶可以改善心肌病小鼠的心功能。腺苷酸環化酶用于心力衰竭的治療目前在進行臨床試驗[17,18]。抑制磷酸二酯酶2而增加cAMP的水平可以阻止心肌肥厚[19]。此外,cAMP活化的PKA使其底物組蛋白脫乙酰酶磷酸化具有心肌細胞肥大的作用[20,21]。因此本實驗提出假設:作為cAMP-PKA的上游,多巴胺1類受體(多巴胺受體1和多巴胺受體5)活化可以減輕心力衰竭早期的炎癥反應。

在本實驗中,使用實時熒光定量PCR檢測心力衰竭小鼠心臟組織中多巴胺受體的mRNA水平,結果發現與假手術組相比,多巴胺受體1、多巴胺受體3與多巴胺受體4的水平沒有改變,多巴胺受體2的mRNA水平降低,多巴胺受體2在心力衰竭中的作用以往有文獻報道。多巴胺受體5水平明顯升高。為了進一步驗證多巴胺受體5在心力衰竭中的改變,我們通過免疫組化方法觀察心力衰竭小鼠心臟多巴胺受體5的表達,與對照組相比,該受體的表達明顯增多,提示多巴胺受體5參與心力衰竭的發生發展。為了研究多巴胺受體5在心力衰竭早期炎癥反應中的作用,我們采用橫向主動脈弓縮窄術后1周的小鼠,心臟多普勒超聲檢查橫向主動脈弓縮窄術后1周血流峰值,結果可以看到橫向主動脈縮窄術后血流峰值可達2 000 mm/s,而假手術組血流峰值為800 mm/s,提示橫向主動脈弓縮窄術成功。橫向主動脈弓縮窄術小鼠腹腔連續注射非諾多泮1周觀察其對炎癥反應的影響,結果發現與對照組相比,非諾多泮明顯減少心臟炎癥細胞的數量及炎癥介質的水平。提示多巴胺受體具有抑制心力衰竭早期心臟的炎癥反應。我們同時觀察非諾多泮對心力衰竭早期心功能的影響,與對照組相比,反應心功能的射血分數與短軸縮短分數沒有明顯的變化。以上結果提示多巴胺受體5在心力衰竭的早期主要介導心臟的炎癥反應。

本研究發現多巴胺受體5活化后可以抑制心力衰竭早期炎癥反應,多巴胺受體5對心力衰竭晚期心肌肥厚及心肌纖維化是否有影響,我們將在多巴胺受體5轉基因小鼠中進行深入研究,本研究首次發現了多巴胺受體5在心血管疾病中的新作用,可能為心力衰竭的臨床治療提供一定的理論和實踐依據。