消痔洗劑提取工藝研究

丁美林 宗 陽 徐玲玲 周建華 蔣 勇 江建國*

1.江蘇省如東縣中醫(yī)院，江蘇 如東 226400；2.蘇州市中醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 200120

消痔洗劑為江蘇省如東中醫(yī)院的外用經(jīng)驗(yàn)方，由黃柏、虎杖、敗醬草、魚腥草等六味藥組成，具有清熱利濕解毒、散瘀止痛、去腐消腫的功效，臨床用于肛腸病術(shù)后創(chuàng)面疼痛、出血、肛緣水腫、創(chuàng)面恢復(fù)。經(jīng)多年臨床應(yīng)用并驗(yàn)證，該洗劑使用方便、療效良好，尚未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，年使用量大于12000瓶。方中黃柏為君藥，魚腥草為臣藥。現(xiàn)代藥理研究[1-3]表明黃柏對皮膚有抗菌、抗炎、抗氧化等作用，其中鹽酸小檗堿抗炎作用研究較多。魚腥草揮發(fā)油是發(fā)揮抗炎、抗菌作用重要成分[4-5]。

研究根據(jù)《中國藥典》(2020年版)四部項(xiàng)下?lián)]發(fā)油測定法[6]，以揮發(fā)油提取體積、提取量為考察指標(biāo)，通過單因素考察，確定魚腥草揮發(fā)油最佳提取工藝。水提取工藝提取，根據(jù)處方分析以君藥黃柏中鹽酸小檗堿為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜法(HPLC)法結(jié)合正交試驗(yàn)，以鹽酸小檗堿含量、干膏率的綜合評價為指標(biāo)，考察加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)對消痔洗劑指標(biāo)成分含量的影響，優(yōu)選出最佳提取工藝，以期為醫(yī)院制劑的質(zhì)量控制和制備工藝提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AT島津高效液相色譜儀(日本島津公司)；AE-240電子分析天平(上海賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；QCD3120超聲波清洗器(天津旗美科技有限公司)；HN101-1A鼓風(fēng)干燥箱(南通滬南科學(xué)儀器有限公司)；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國宇儀器制造有限公司)。

1.2 材料 鹽酸小檗堿(批號：110713-202015，中國食品藥品鑒定研究院)。高效液相色譜所用試劑為色譜純，水為去離子水，其他試劑為分析純。所用中藥飲片均購自南通市三越飲片有限公司，并由本院主任中藥師鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 魚腥草揮發(fā)油的提取

2.1.1 浸泡時間與吸水率的考察 稱取處方量藥材2份，置于燒杯中，分別加入12倍量的水，用保鮮膜封住燒杯口，分別在室溫下靜置0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，并稱量重量，每次分別倒出被藥材吸收剩下的藥液體積，計算吸水率[7]，最終確定藥材的浸泡時間為2 h，藥材吸水率為393%。

2.1.2 加水量的考察 取4份藥材，分別加入10、12、14、16倍處方量水，浸泡2 h后，加熱提取5 h，收集揮發(fā)油，計算揮發(fā)油提取率，確定加水量為14倍處方量。結(jié)果見表1。

表1 魚腥草加水量的考察

2.1.3 提取時間的考察 取4份藥材，分別加入14倍處方量水，浸泡2 h后，分別加熱提取揮發(fā)油3、4、5、6 h，收集揮發(fā)油，計算魚腥草揮發(fā)油提取率，確定提取時間為5 h。結(jié)果見表2。

表2 魚腥草提取時間的考察

2.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 對魚腥草浸泡時間、加水量、提取時間進(jìn)行考察，最終確定魚腥草揮發(fā)油提取工藝，即加入14倍處方量的水，浸泡2 h，提取 5 h。按照確定最佳提取工藝，稱取3份魚腥草平行操作，結(jié)果表明此工藝合理可行，具有較好的穩(wěn)定性。結(jié)果見表3。

表3 揮發(fā)油提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

2.2 水提取工藝優(yōu)選

2.2.1 浸泡時間與吸水率的考察 稱取處方量藥材，置于燒杯中，分別加入7倍量的水，用保鮮膜封住燒杯口，分別在室溫下靜置0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，量取體積，稱取重量，計算吸水率，最終確定浸泡時間為1.5 h，藥材吸水率為156%。

2.2.2 溶液配制 對照品溶液：精密稱取鹽酸小檗堿10.26 mg，用流動相溶液定容于10 mL容量瓶，即得。

供試品溶液的制備：按處方量稱取藥材，加入8倍量的水，浸泡2 h，煎煮1 h后，精密吸取10 mL提取液，水浴蒸干后，用流動相定容10 mL容量瓶中，即得。

陰性供試品溶液的制備：按處方量稱取除黃柏外的藥材，按“供試品溶液”項(xiàng)下的方法制備，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Inertrustain C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加入十二烷基硫酸鈉0.1 g)，柱溫30 ℃，流速1 mL/min；對照品進(jìn)樣量5 μL，供試品進(jìn)樣量20 μL。

2.2.4 專屬性 分別吸取對照品溶液、供試品溶液、缺黃柏的陰性供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣分析，陰性供試品溶液在對照品相應(yīng)位置無吸收，表明鹽酸小檗堿無陰性干擾。色譜圖見圖1。

圖1 消痔洗劑中鹽酸小檗堿的色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密量取適量的對照品溶液，加入流動相進(jìn)行稀釋至123.39、105.76、83.76、70.51、52.88、32.25、17.63 μg/mL的濃度對照品溶液。分別吸取各濃度的對照品溶液 5 μL，注入高效液相色譜儀中測定。得到現(xiàn)性方程為y=2440.76x+44273，(r=0.999)，鹽酸小檗堿在17.63～123.39 μg/mL間現(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一對照品溶液，按色譜條件進(jìn)樣檢測，重復(fù)測定6次，以峰面積計算，RSD為0.06%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品，按“供試品溶液”制備方法平行制備6份，按色譜條件進(jìn)樣檢測，測定鹽酸小檗堿含量的RSD為0.91%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h分別進(jìn)樣，測定色譜峰面積，RSD為0.11%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率 精密吸取已知含量的同一批供試品溶液共6份，加入適量鹽酸小檗堿對照品溶液，按“供試品溶液”制備方法制備供試品溶液，測定鹽酸小檗堿的含量，平均回收率為101.98%，RSD為1.59%(n=6)。

2.3 正交試驗(yàn) 試驗(yàn)根據(jù)臨床用藥方法，確定采用水提方法進(jìn)行提取，影響水提主要因素為A加水量(倍)、B煎煮時間(h)、C煎煮次數(shù)(次)。采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)選最佳提取工藝參數(shù)。因素與水平見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表4 因素水平表

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

續(xù)表5

表6 方差分析結(jié)果

分析表明，在中藥水提過程中，煎煮時間為顯著性影響因素(P<0.05)，可根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳提取工藝為A3B2C2，即加12倍量的水，煎煮1.5 h，提取2次。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取與正交試驗(yàn)等量飲片3份，按優(yōu)選的提取工藝提取，結(jié)果見表7，表明優(yōu)化水提工藝提取率較高，工藝穩(wěn)定。

表7 水提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

肛腸疾病的基本病因病機(jī)一般受風(fēng)濕熱燥等外邪的作用、情志內(nèi)傷、飲食起居等因素的影響，濕熱下注于大腸，經(jīng)絡(luò)阻滯，氣血不暢，淤血濁氣留滯肛門大腸而衍生諸多病癥[8-9]。西醫(yī)治療多采用高錳酸鉀等坐浴方式，但治療效果并不理想[10]。消痔洗劑為如東縣中醫(yī)院肛腸科臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱利濕解毒、散瘀止痛、去腐消腫等功效，臨床上有消除痔瘡炎癥腫脹脫出、嵌頓、抗菌等作用，促進(jìn)痔瘡術(shù)后創(chuàng)面愈合作用，臨床使用超過十年，臨床研究[11-12]表明患者使用效果良好，值得應(yīng)用推廣，表明該制劑制備工藝可以深入開發(fā)。

采用單因素試驗(yàn)考察揮發(fā)油提取工藝時，曾考察魚腥草、敗醬草、魚腥草和敗醬草三組揮發(fā)油提取，在實(shí)驗(yàn)的1 h內(nèi)可清晰看到魚腥草黃色揮發(fā)油，而敗醬草在實(shí)驗(yàn)的4 h后看到少量的聚集物顯紅色，且聚集物呈白色無定形粉末狀漂浮于油面，敗醬草的揮發(fā)性成分極其少。魚腥草和敗醬草共同提取得到棕紅色的揮發(fā)油且油內(nèi)夾雜著白色無定形粉末。實(shí)驗(yàn)采用的敗醬草為黃花敗醬草，現(xiàn)代研究[13]表明，黃花敗醬草雖含揮發(fā)性成分，但未發(fā)現(xiàn)相關(guān)大量的研究敗醬草中揮發(fā)油，且藥理作用尚未清晰，加之黃花敗醬草提取出難容于水油的白色粉末狀物質(zhì)[14]，為不影響后期的實(shí)驗(yàn)研究，本實(shí)驗(yàn)去除黃花敗醬草的揮發(fā)性成分提取。最終確定魚腥草揮發(fā)油提取工藝加入14倍量的水，浸泡2 h，提取5 h，該工藝合理可行。

黃柏為方中君藥，具有瀉火解毒，清熱燥濕，除骨蒸、退虛熱等功效，其化學(xué)成分主要有生物堿類、酚酸類、黃酮類、多糖類等，具有抗菌、抗炎、消腫、止痛等藥理作用[15-16]。水提工藝考察過程中，根據(jù)處方分析，將君藥黃柏中鹽酸小檗堿、干膏率作為考察指標(biāo)[17-18]，設(shè)計正交試驗(yàn)。參照文獻(xiàn)[19-20]對色譜條件多次考察，最終確定色譜條件參照2020版《中國藥典》一部黃柏項(xiàng)下含量測定[21]，實(shí)驗(yàn)表明該色譜條件分離度良好，陰性供試品對本法測定無干擾。最終確定水提工藝為加入12倍量的水，浸泡1.5 h，提取1.5 h，煎煮2次，該工藝穩(wěn)定可行。

綜上所述，消痔洗劑的提取工藝分兩步提取。第一步考察魚腥草揮發(fā)油提取工藝，由于魚腥草揮發(fā)油抗菌抗炎活性較好[22-23]，增強(qiáng)消痔洗劑抗菌抗炎效果，將魚腥草揮發(fā)油充分得到應(yīng)用。第二步考察魚腥草藥渣、黃柏、虎杖、芒硝、敗醬草等中藥的提取工藝，采用水提工藝合理可行。結(jié)果表明消痔洗劑提取工藝合理穩(wěn)定可行，后續(xù)開發(fā)將繼續(xù)按照外用中藥洗劑的要求，結(jié)合現(xiàn)代化技術(shù)對該洗劑進(jìn)一步考察開發(fā)。