民族藥黑骨頭藥材杠柳毒苷含量測定的方法研究

楊勇幫 李健田 白 玥

1.云南省玉溪市食品藥品檢驗所，云南 玉溪 653100；2.普洱學院，云南 普洱 665000

民族民間用藥是中華傳統醫藥的重要組成部分，其歷史悠久并具很強的地域性。黑骨頭為云南省哈尼族、彝族常用藥材[1]，別名有鐵骨頭、牛尾蕨、青蛇膽、黑龍骨、青風藤等。主要用于腰痛、風濕麻木、跌打損傷及蛇咬傷的治療。黑骨頭最早是《云南省藥品標準》(1974)[2]収載品種，現為《云南省中藥材標準》(2005年版)[3]収載品種；其植物來源為蘿藦科植物黑龍骨PeriplocaforrestiiSchltr.及青蛇藤Periplocacalophylla(Wight) Falc.的干燥老莖和根。《云南省中藥材標準》(2005年版)黑骨頭藥材標準項下初步制訂了名稱、來源、性狀、薄層鑒別、檢查(水分、總灰分)、浸出物等項目，但沒有對其指標成分進行定性和含量測定；難以控制藥材的質量，無法保證臨床用藥的安全性和有效性。因此完善和提高黑骨頭藥材質量標準顯得非常有必要。

現代對黑骨頭藥材的研究，更多的是對植物黑龍骨的成分研究[4-6]；而對植物青蛇藤的研究非常少見，僅見《青蛇藤化學成分研究》《青蛇藤正丁醇部分苷類成分的分離與鑒定》等文獻。現有的文獻報道，黑骨頭的研究多集中在化學成分、總皂苷、總黃酮及槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷的含量測定和藥理作用等方面，未見關于黑骨頭和杠柳毒苷定性鑒別及含量測定方法的研究報道[7]。對于黑骨頭藥材質量標準研究，特別是采用HPLC方法測定青蛇藤中杠柳毒苷的含量研究，目前尚無相關研究的文獻報道。因此，本實驗確定以強心苷類具有促進傷口愈合作用的杠柳毒苷作為控制指標，對黑骨頭藥材中杠柳毒苷成分的含量進行測定，并對其方法進行驗證，以便能更全面地分析評價其藥材質量和安全性。為民族藥黑骨頭的質量標準控制提供參考，同時也為黑骨頭藥材及相關制劑進一步研究和開發提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ME403E 103型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)、CPX5800H-C型超聲清洗儀(必能信超聲(上海)有限公司)、BP211D型電子天平(賽多利斯)、DHG-9140A型鼓風干燥箱(上海合恒儀器有限公司)、1260 Infinity型高效液相色譜儀(安捷倫科技)、粉碎機(瑞安市永歷制藥機械有限公司)、MS204型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)、Cavy 60 UV-Vis型紫外可見分光光度計(安捷倫科技)、DESA6A薄層色譜板成像儀。

1.2 材料 杠柳毒苷對照品(純度：98%，CAS No.13137-64-9，成都普瑞法科技開發有限公司)純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)，三氯甲烷、丙酮、甲醇、無水乙醇、95%乙醇均為四川西隴科學有限公司，30%乙醇、45%乙醇、70%乙醇(現配現用，均用無水乙醇和純凈水配制)，乙腈(色譜純，四川西隴科學有限公司)，所用試劑除乙腈外均為分析純，并且均在有效期內。

云南地產藥材黑骨頭，經玉溪市食品藥品檢驗所副主任中藥師牟娟鑒定為蘿藦科植物青蛇藤Periplocacalophylla(Wight) Falc.的干燥莖切片。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 溶液的制備 供試品制備：將黑骨頭樣品粉碎成粗粉，過2號篩，取藥材粉末約2 g，加入甲醇25 mL，超聲提取30 min，將濾液過濾后放在恒溫水浴鍋上蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。對照品溶液制備：取杠柳毒苷對照品適量，加入甲醇溶解制成1 mg/mL溶液，作為對照品試液。

樣品 對照品

樣品 對照品

2.1.2 薄層色譜 鑒別照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部[8])試驗，分別吸取供試品溶液10 μL，杠柳毒苷對照品溶液20 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，將薄層板置于展開缸中預飽和15 min，以三氯甲烷：丙酮：水(10∶3∶1)為展開劑上行展開，展開，取出，揮干溶劑，噴以5%硫酸乙醇溶液并在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別又置于紫外光燈(365 nm)下視檢。供試品色譜中在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點和熒光斑點。可以初步確定黑骨頭藥材中含有杠柳毒苷。結果見圖1、圖2。

2.2 杠柳毒苷含量的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：以水為流動相A，乙腈為流動相B，按表1所示流動相洗脫程序；柱溫25 ℃：檢測波長220 nm，流速 1 mL/min。對照品及供試品色譜圖如圖3、圖4所示。

表1 流動相洗脫程序

圖3 對照品圖譜

圖4 樣品圖譜

2.2.2 對照品溶液的制備 取杠柳毒苷對照品適量，精密稱定，加45%乙醇溶液制成每1 mL含0.207 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取黑骨頭粉末約2 g，置于錐形瓶中，精密量取45%乙醇25 mL加入至錐形瓶，稱定重量。置于超聲提取30 min，再次稱重，補足減失的重量后過濾，取續濾液作供試品溶液備用。

2.2.4 檢測波長的確定 將制備好的對照品溶液取適量置于比色皿中，放入Cavy 60 UV-Vis型紫外可見分光光度計中進行全波長掃描，最終確定杠柳毒苷最大吸收波長為220 nm。

2.2.5 線性關系的考察 稱取杠柳毒苷對照品10.57 mg至50 mL容量瓶中，加入45%乙醇溶液至刻度，即得到濃度為0.207 mg/mL的對照品儲備溶液。取杠柳毒苷對照品儲備溶液25 mL至 100 mL 量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到濃度為0.052 mg/mL杠柳毒苷溶液。取1 mL濃度為 0.052 mg/mL 杠柳毒苷溶液至10 mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到0.0052 mg/mL杠柳毒苷溶液；取2 mL濃度為0.052 mg/mL杠柳毒苷溶液至10 mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到 0.0104 mg/mL 杠柳毒苷溶液；取5 mL濃度為0.052 mg/mL杠柳毒苷溶液至10 mL量瓶45%乙醇溶液至刻度，得到0.026 mg/mL杠柳毒苷溶液；取5 mL濃度為0.207 mg/mL杠柳毒苷溶液至 10 mL 量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到 0.104 mg/mL 杠柳毒苷溶液；再取0.052、0.207 mg/mL 的對照品溶液，共計6個不同濃度的對照品溶液，按色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；以水為流動相A，乙腈為流動相B按表1所示流動相洗脫程序；柱溫25 ℃：檢測波長220 nm，進行高效液相色譜分析，以進樣濃度(mg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程Y=6225X+0.2665,R2=0.9999，在0.005 mg/mL～0.207 mg/mL濃度范圍內，線性關系良好。

2.2.6 精密度試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液按“2.2.1”色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，結果杠柳毒苷峰面積RSD值為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 按供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中進行測定峰面積，計算含量得平均含量為0.5717 mg/g，RSD值為1.4%，表明方法重復性良好。

2.2.8 穩定性試驗 取供試品溶液，分別在室溫0 h、4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h的時間下按“2.2.1”色譜條件進行測定峰面積，RSD值為0.59%。表明供試品在24 h內穩定。

2.2.9 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量(0.5717 mg/g)的供試品6份至不同的錐形瓶中，精密加入杠柳毒苷對照品溶液(0.207 mg/mL)3 mL ，照供試品溶液的制備方法制備。取上述6份供試品溶液分別進樣10 μL，測定其峰面積并計算含量。根據(《中國藥典》2015版四部)分析方法驗證指導原則準確度計算方法(用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量)，即計算加樣回收率=(實測含量-所取樣品含量)/加入對照品量×100%)及RSD值。結果：平均回收率為99.1%，RSD為0.94%，表明該HPLC檢測條件、方法的可靠性強。如表2所示。

表2 加樣回收實驗

2.2.10 樣品測定 取3批樣品，分別取2 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，進樣。按色譜條件進行測定峰面積，計算含量結果見表3所示。

表3 樣品測定結果

3 結論與討論

通過按本試驗方法條件進樣考察，表明線性關系良好、儀器精密度良好、方法重復性良好、供試品溶液在24 h內基本穩定，本方法所測的黑骨頭藥材樣品中的杠柳毒苷含量為0.5717mg/g(0.057%)，根據(《中國藥典》2015版四部)中對高效液相色譜法回收率的要求，其在85%～90%至108～110%之間均符合標準規定。本次加樣回收試驗杠柳毒苷的回收率為99.1%，在標準規定允許范圍內。表明該方法準確、可靠，對今后黑骨頭藥材的質量控制和科學評價提供了參考依據。通過前期的實驗考察，采用不同的柱溫分別觀察色譜柱的分離能力，最終確定柱溫25℃分離度最好。以水為流動相A，乙腈為流動相B，不同梯度洗脫程序進行驗證，最終確定洗脫程序。經過多次實驗，最終確定使用C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)分離效果好、達到實驗要求。

通過對黑骨頭藥材的初步研究，發現云南習用的黑骨頭藥材來源大多是蘿藦科植物青蛇藤的干燥老莖。通過查閱相關文獻及采用薄層色譜鑒別方法，并與杠柳毒苷對照物質的比較，初步確定了藥材青蛇藤中含有杠柳毒苷，為后續采用高效液相色譜法測定杠柳毒苷含量奠定了物質基礎，同時為完善及提高黑骨頭藥材標準打下堅實的基礎。