車前草水提物對環磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影響

李燕華 梁月琴 李叢元 李翠紅 夏洪穎 李仲昆

昆明市延安醫院，云南 昆明 650051

車前草(Ribwort plantain)為車前科植物車前或平車前的干燥全草，為世界范圍內應用最廣泛的藥用植物之一[1-2]。具有涼血、清熱、解毒、利尿、祛痰、抗腫瘤、神經和免疫調節的作用[3-6]，可治療熱淋澀痛、暑濕瀉痢、水腫尿少、癰腫瘡毒、痰熱咳嗽、吐血衄血等疾癥[7]。免疫系統在抵抗微生物和外來抗原方面起著重要的作用，它參與了由宿主免疫狀態所決定的疾病的發生與恢復，如癌癥、肥胖、糖尿病、肺結核等，對于免疫介導性疾病的預防和康復都至關重要。免疫器官(如骨髓、胸腺、脾臟、扁桃體、淋巴結、粘膜免疫系統包括腸黏膜派氏淋巴結(Peyer′s patches，PPs)、免疫細胞、免疫分子都是機體免疫系統的重要組成部分[8]。環磷酰胺(Cyclophosvnamide,CY)是一種烷基化劑，被廣泛應用于免疫治療和腫瘤化療，其不良反應包括免疫抑制、骨髓抑制、白細胞減少和氧化應激等[9-11]。有報道[12]稱，CY可產生氧化應激，介導氧化還原平衡的破壞，導致生化和生理上的干擾。CY可破壞Th1/Th2平衡[12]，誘導T細胞和B細胞的絕對計數下降[13]。目前對車前草多種藥用價值的報道甚多，但對腸道免疫功能的影響尚未報道。研究擬通過觀察小鼠體重變化率、臟器指數、腸黏膜PPs的數量及淋巴細胞表型、細胞因子水平等指標的變化，初步探討PAE對腸道免疫功能的影響，為開發利用車前草提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物 車前草購自云南新世紀中藥飲片藥有限公司，經云南省楚雄州人民醫院羅寶生主任藥師鑒定為車前草屬車前草科植物PlantagoasiaticaL。取干燥車前草100 g，煎煮2次，第1次煎煮前先用純水浸泡約20 min，水量為浸過藥面1～3 cm，先用武火煮沸，再改用文火煎煮30 min。合并2次水煎液，用旋轉蒸發儀將水煎液濃縮至100 mL，得到車前草水提物，濃度為1 g/mL，含生藥量為1 g/mL，冷藏備用，給藥劑量按生藥量計算。0.9%氯化鈉注射液(批號G115051701，四川科倫藥業股份有限公司)；注射用CY(批號15102925，江蘇盛迪醫藥有限公司)。

1.2 動物 6～8周齡18～22g的SPF級ICR雄性小鼠60只，自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購入，動物許可證號SCXK(湘)2013-0004。飼養于昆明市延安醫院中心實驗室動物房，保持室溫25±2℃，濕度50%±5%。

1.3 試劑 改良RPMl-l640培養基(賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司)；胎牛血清(FBS，法國Biowest公司)；抗小鼠CD3e-FITC、抗小鼠CD19-PE購自美國BD-Pharmingen公司；MouseIL-4 ELISA kit、Mouse IFN-Y ELISA kit購自欣博盛生物科技有限公司，其他試劑均為分析純。

1.4 儀器 全自動酶標儀Model550(美國BIO-RAD公司)；FACSCalibur流式細胞儀(FC-500)(美國Beckman公司)；LEGENDMICRO17臺式微量離心機(美國 Thermo公司)；TD5M低速多管架自動平衡離心機(長沙萬佳森儀器設備有限責任公司)；FA2004電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；RE-52A型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.5 動物分組、造模及給藥 60只SPF級ICR健康雄性小鼠隨機分為正常對照組、模型組、PAE低、中、高劑量組，每組12只。PAE低、中、高劑量組分別每天按0.25、0.5、1.0 g/kg灌胃，正常對照組、模型組給予與PAE體積相當的NS灌胃，共14 d。在實驗第9d開始模型組和PAE各劑量組小鼠隔日給予CY注射液50 mg/kg腹腔注射，共3次，正常組小鼠給予等體積生理鹽水腹腔注射，末次注射CY 24h后頸椎脫臼處死小鼠，取材進行各項指標檢測。

1.6 體質量增率、脾臟及胸腺指數測定 上述各組小鼠連續灌胃14 d后稱取體質量并頸椎脫臼處死，無菌條件下分離脾臟和胸腺剔除脂肪和結締組織后稱重，分別計算體質量增率、脾臟及胸腺指數：凈體質量增率=(處死時體質量-初始體質量)/初始體質量×100%，臟器指數(%)=臟器重量(g)/小鼠體質量×100%。

1.7 PPs細胞表型的測定

1.7.1 PPs計數 將腸腔沖洗干凈，迅速放入含5%胎牛血清(5%FBS)的RPMI1640培養基的培養皿中，肉眼可見外腸壁上米白色麥粒樣圓形突起即為派氏結(PPs)，計數PPs個數。

1.7.2 PPs細胞表型測定 用眼科鑷和眼科剪小心分離出小腸外壁PPs，將PPs迅速浸入RPMI1640液的培養皿中，將PPs移入經RPMI1640液浸潤過的120目細胞篩中，用研磨棒加適當力度輕輕研磨，再RPMI1640液沖洗過濾；取其過濾液再經200目細胞篩過濾后收集濾液加至 5 mL，以 2000 r/min 離心 10 min，棄上清液，加入RPMI1640液約 3 mL，重懸細胞即得PPs細胞懸液。將收集到的PPs細胞懸液進行細胞計數并調節細胞濃度至1×107/mL，分別取100 μL細胞移入流式細胞專用管進行熒光標記，每管依次加入抗小鼠CD3e-FITC，CD19-PE單克隆抗體各0.5 μg，混勻后 4 ℃ 避光 30 min，熒光標記結束后，用PBS洗滌細胞2次后重懸于400 μL的PBS中用流式細胞儀檢測細胞表型。

1.8 ELISA檢測細胞因子分泌水平 打開小鼠腹腔取出全段小腸，向將NS3 mL注入腸腔內，保留并輕輕晃動4 min，使腸內容物充分混勻溶解，收集腸腔內的NS于EP管中，3000 r/min離心 10 min，取上清液，編號備用，按酶聯免疫技術(ELISA)鼠IL-4、IFN-γELISA試劑盒說明書上的流程操作進行檢測操作，以酶標儀測定腸黏膜IL-4、IFN-γ的光密度值。

2 結果

2.1 PEA對免疫抑制小鼠體重增加率、胸腺及脾臟指數的影響 與正常對照組相比較，模型組、PEA低、中、高劑量組體重增加率、胸腺指數均顯著降低(P<0.05)，模型組、PEA低、中劑量組脾臟指數顯著降低(P<0.05)；與模型組相比較，PEA中、高劑量組的體重增率顯著增高(P<0.05)，PEA低、中、高劑量組脾臟指數和胸腺指數顯著升高(P<0.05)；與PEA低劑量組相比較，PEA中、高劑量組體重增率、脾臟指數和胸腺指數顯著升高(P<0.05)；與PEA中劑量組相比較，PEA高劑量組體重增率、脾臟指數和胸腺指數顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體重、臟器的指數化情況

2.2 PEA對PPs數目及淋巴細胞表型的測定 與正常對照組相比較，模型組、PEA低、中劑量組小鼠腸黏膜PPs數目及CD19+細胞比例均顯著降低(P<0.05)，模型組、PEA低劑量組小鼠腸黏膜PPs內CD3+細胞比例顯著升高(P<0.05)；與模型組相比較，PEA低、中、高劑量組小鼠腸黏膜PPs數目及CD19+細胞比例均顯著升高(P<0.05)，CD3+細胞比例顯著降低(P<0.05)；與PEA低劑量組相比較，PEA中、高劑量組小鼠腸黏膜PPs數目顯著升高(P<0.05)，PEA高劑量組的小鼠腸黏膜CD19+細胞比例顯著升高(P<0.05)，CD3+細胞比例顯著降低(P<0.05)；與PEA中劑量組相比較，PEA高劑量組小鼠腸黏膜PPs數目顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 PEA對各組小鼠腸黏膜PPs數目及淋巴細胞表型的影響

2.3 PEA對細胞因子的調節 與正常對照組相比較，模型組、PEA低、中劑量組小鼠腸黏膜IFN-γ、IL-4濃度均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比較，PEA低、中、高劑量組小鼠腸黏膜IFN-γ、IL-4濃度比值均顯著升高(P<0.05)；與PEA低劑量組相比較，PEA中、高劑量組小鼠腸黏膜IFN-γ、IL-4濃度比值均顯著降低(P<0.05)；與PEA中劑量組相比較，PEA高劑量組小鼠腸黏膜IFN-γ、IL-4濃度比值均顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠腸黏膜IFN-γ、IL-4分泌量

3 討論

胸腺是機體的中樞免疫器官，也是參與細胞免疫和T細胞分化、發育和成熟的重要器官；脾臟是機體最大的外周淋巴組織器官，是機體的免疫中心，含有大量NK細胞、記憶T細胞及Th細胞等，在機體免疫中都發揮著重要作用。免疫器官所含免疫細胞數量及功能與其重量密切相關，臟器指數可在一定程度上反應機體免疫功能的強弱，因此，脾臟及胸腺重量的改變可初步反映出受試物對機體免疫系統的影響[14]。

PPs富含T細胞(約為40%)和B細胞(約為60%)，在免疫監視和細胞介導的黏膜免疫中具有重要作用；是誘導細胞增殖活化和抵御腸道內有害物質侵襲的主要部位，PPs中淋巴細胞及其亞群的數量和活性狀態可作為反映腸道黏膜局部的免疫狀態的指標[15]。CD3分子為T細胞的特有標志，表達于成熟的T淋巴細胞表面。CD19分子是與B細胞增殖、分化、活化及抗體產生有關的重要膜抗原，存在于全體B細胞表面，是最重要的B細胞標記因子。茯苓多糖能拮抗CY誘導的各淋巴組織中T、B細胞亞群的失衡，尤其是腸道免疫系統作用[16]，表現為PPs細胞中CD3+細胞比例下降，CD19+細胞比例上升。

維持腸黏膜系統免疫功能平衡的另一個重要因素是細胞因子。輔助性T細胞(helperTcell，Th)可分為Th1和Th2兩種類型，對機體免疫有重要的調節作用。其中Th1細胞調節細胞免疫，促進細胞毒性活動和炎癥反應，與遲發型超敏反應的發生和機體抗腫瘤作用有關，主要分泌IFN-γ和IL-2等細胞因子；Th2細胞輔助B細胞增殖分化為漿細胞，分泌抗體調節體液免疫，主要分泌IL-4等細胞因子；IFN-γ和IL-4分別是Th1和Th2細胞的特征性細胞因子。

CY是治療惡性腫瘤最常用的烷化劑，屬廣譜抗腫瘤藥物，可抑制細胞的DNA合成、干擾細胞的增殖、抑制抗體形成，是臨床上治療腫瘤和免疫性疾病的常用藥物之一[8]，其主要毒副作用是免疫和骨髓抑制。在既往的研究[16-18]中提示注射CY可出現免疫抑制，表現為實驗動物體重、臟器指數、腸黏膜PPs的數量及細胞因子水平降低，PPs內CD3+細胞比例升高，CD19+細胞比例均降低，本研究的結果與之相同。在有的研究中顯示PPs內CD3+細胞數量降低，由于在本研究并未測量PPs內CD3+、CD19+細胞的絕對數量，CD3+細胞比例的升高考慮為CD19+細胞下降較多引起PPs內細胞總數降低所致。

許多天然物質(包括植物來源和動物來源)具有調節先天和適應性免疫功能和抗氧化的特性，臨床上已經使用許多中草藥來預防化療藥物的毒副作用[8，19-20]。有許多生物活性多糖對免疫系統有較深的影響，且無明顯毒副作用，具有免疫調節功能[21]，如促進細胞因子或趨化因子分泌、激活補體系統和免疫相關細胞等[22]。同時在眾多的研究中，許植物多糖[16，18]能夠對抗CY引起的免疫抑制狀態如：實驗動物體重、臟器指數、腸黏膜PPs的數量及細胞因子水平降低，PPs內淋巴細胞表型比例的改變。在本研究中，PEA已表現出了與前述報道相似的改變，尤其以中、高劑量組明顯，然而中、高劑量之間的差異不明顯。

PAE預處理可改善CY致免疫抑制小鼠的免疫功能。由于本文僅研究車前草水提物對環磷酰胺致免疫抑制小鼠的免疫功能是否有影響及其影響的程度，故并未設立陽性對照組，有關車前草水提物與其它免疫調節劑的比較，有待進一步深入的研究。