馬錢子堿治療早期小鼠膝骨關節炎的作用機制研究*

向 杰，張海燕，李 多，朱明雙

1.南充市中醫醫院(南充 637000)；2.成都中醫藥大學(成都 610072)；3.成都中醫藥大學附屬醫院(成都 610072)

膝骨關節炎(knee osteoarthritis,KOA)是由力學和生物學等多種原因引起，以關節軟骨退變和破壞為主要病理改變，且與年齡呈正相關的關節退行性疾病[1]。雖然KOA的病情進展緩慢，但早期若不對KOA病變進行干預，會導致膝關節功能紊亂，發生嚴重畸形，甚至導致殘疾。據流行病學[2-3]報道，KOA已成為全球性的公共衛生問題，并隨著社會老齡化發展該疾病發病率呈上升趨勢。在美國<65歲人群中，約有1 400萬人患有癥狀性KOA，而這其中有超過半數的患者為中晚期KOA[4]。此外，KOA引起的膝關節疼痛、畸形等癥狀還會增加心血管發生率和全因死亡率[5-6]。因此，緩解KOA疼痛等癥狀及延緩疾病進程對KOA患者具有重要意義。

馬錢子是馬錢科植物馬錢的成熟干燥種子，古今醫家對這味傳統中藥在骨關節炎的臨床應用中積累了豐富經驗，認為此藥治療骨關節炎效果良好。如婁多峰教授秉承治療痹病應“以通為用”的學術觀點，認為馬錢子既可通痹止痛，又可與補虛藥相伍，以扶正祛邪，標本兼治，實為治痹之要藥[7-8]。王云川教授亦善運用馬錢子治療骨痹病，且療效明顯[9]。馬錢子堿是從馬錢子中提取的吲哚類生物堿，其發現約有200年歷史[10]。研究[11]報道，馬錢子堿是馬錢子的主要有效成分，但它的毒性遠低于馬錢子，其在治療骨關節炎疾病中展現出較大潛力。雖然已有研究[12-13]證實，馬錢子堿治療骨關節炎療效確切，但其作用機制研究報道較少。因此，本研究擬通過構建KOA動物模型，觀察馬錢子堿對KOA模型小鼠軟骨病變的影響，探討馬錢子堿治療KOA小鼠的作用機制，為馬錢子堿的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

10～12 周齡SPF 級的C57BL/6 雄性小鼠，體重(24±3)g，共24只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2017-204。

1.2 藥物及試劑

馬錢子堿(成都德思特生物技術有限公司)；番紅-固綠染液(北京雷根生物科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(北京索萊寶科技有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白酶和磷酸化酶抑制劑混合物(上海碧云天生物技術有限公司)；ECL試劑盒(美國Bio-Rad公司)；β-actin抗體(英國Abcam公司)；MTs、ZNT9ZIP8、MTF1抗體(美國Fisher公司)。

1.3 儀器

數碼三目攝像顯微鏡BA400Digital(成都麥克奧迪有限公司)；高速冷凍離心機H1850R(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；微量核酸蛋白分析儀N50t(德國Implen公司)；熒光定量PCR儀CFX Connect、凝膠電泳儀PowerPacTM Basic(美國 BIO-RAD 公司)；全波長酶標儀MULTISKAN GO(美國Thermo Scientific公司)；圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0(美國 Media Cybernetics公司)；全自動化學發光凝膠成像系統Champ Chemi 610(北京賽智創業科技有限公司)。

1.4 藥物制備

馬錢子堿溶液配置方法：首先用DMSO溶解馬錢子堿，將其配制成98.6 g/L的儲備液，-20 ℃儲存備用(避光)。實驗前用0.9%生理鹽水稀釋至所需濃度。

1.5 分組、造模及給藥

采用內側半月板失穩(destabilization of the medial meniscus，DMM)的方法建立KOA動物模型[14-16]。C57BL/6小鼠按照完全隨機分組方法將其分為空白對照組和手術組，空白對照組6只，手術組18只，手術組采用DMM方法建立早期KOA動物模型。然后將手術組小鼠隨機分為模型組、馬錢子堿中劑量組、馬錢子堿高劑量組，每組各6只。馬錢子堿中劑量組：每天給予5 mg/kg馬錢子堿溶液腹腔注射；馬錢子堿高劑量組：每天給予10 mg/kg馬錢子堿溶液腹腔注射；模型組：每天給予等體積的生理鹽水腹腔注射；對照組：不采取任何干預措施。給藥過程中密切觀察小鼠情況，藥物干預4周后采集標本。

1.6 樣本采集及觀察指標

1.6.1 樣本采集 處死小鼠前禁食、不禁水12 h，次日上午稱重，水合氯醛(0.05 mL/10 g)麻醉小鼠，用手術剪刀剪開小鼠右側后膝關節皮膚，取小鼠右側后膝關節軟骨，錫箔紙包裹好，并置于液氮中保存，用于后續實驗。

1.6.2 免疫熒光染色技術檢測4組小鼠軟骨組織內Zn2+表達 取小鼠脛骨平臺內側軟骨組織制備10 μm冰凍切片，置于 PBS 溶液中洗滌，在一抗(Zn2+)、二抗溶液中完成孵育后，利用熒光顯微鏡觀察細胞內 Zn2+表達。

1.6.3 RT-qPCR檢測4組小鼠軟骨組織內的ZIP8、ZNT9、MTF1、Mt1、Mt2基因表達 用液氮將小鼠軟骨組織研磨成粉末狀，提取RNA，檢測RNA溶度，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量，β-actin作為歸一化內參基因。PCR引物序列見下表，引物由上海生工生物合成(表1)。

表1 PCR引物序列

1.6.4 蛋白質印跡技術檢測4組小鼠軟骨ZIP8、ZNT9、MTF1、Mts蛋白表達 用液氮將小鼠關節軟骨進行充分研磨，加入RIPA裂解液，冰上勻漿，應用高速冷凍離心機對樣本進行處理，轉速12 000 r/min，離心半徑15 cm，時間5 min，收集上清液。應用BCA法檢測軟骨總蛋白濃度。各孔取20 μg蛋白上樣，200 V電泳進行蛋白分離，PVDF膜100 V濕轉。用ZIP8、ZNT9、MTF1、Mts一抗孵育，封閉過夜。二抗室溫孵育2 h。交替使用TBST和TBS洗滌PVDF膜2次，10 min/次。按ECL試劑盒說明進行顯影拍攝。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析目的蛋白的光密度值(IOD)。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度馬錢子堿對軟骨細胞內Zn2+表達的影響

免疫熒光染色結果顯示，與空白對照組相比，模型組軟骨細胞內Zn2+表達明顯增加，經馬錢子堿藥物干預后，馬錢子堿高、中劑量組小鼠軟骨細胞內Zn2+表達明顯降低，且馬錢子堿高劑量組表達更低(圖1)。

圖1 不同濃度的馬錢子堿對軟骨細胞內Zn2+表達的影響

2.2 4組小鼠關節軟骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MT1、MT2 mRNA表達比較

與空白對照組相比，模型組的ZIP8、MTF1 mRNA相對表達量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，ZNT9、MT1、MT2 mRNA相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組相比，馬錢子堿高劑量組和馬錢子堿中劑量組ZIP8、MTF1 mRNA相對表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，ZNT9、MT1、MT2 mRNA相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。馬錢子堿高劑量組和馬錢子堿中劑量組ZIP8、MTF1相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 4組小鼠關節軟骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MT1、MT2 mRNA表達比較

2.3 4組小鼠關節軟骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MTs蛋白表達量比較

與空白對照組相比較，模型組的ZIP8、MTF1、ZNT9蛋白相對表達量明顯增加(P<0.05)。空白對照組和模型組MTs蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組相比，馬錢子堿高劑量組和中劑量組ZIP8、MTF1蛋白表達量降低(P<0.05)，ZNT9、MTs蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。馬錢子堿高劑量組ZIP8蛋白表達量高于馬錢子堿中劑量組(P<0.05)。馬錢子堿高劑量組和馬錢子堿中劑量組MTF1、ZNT9、MTs蛋白表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)(圖2、表3)。

圖2 4組小鼠關節軟骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MTs蛋白表達

表3 4組小鼠關節軟骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MTs蛋白表達量比較

3 討論

在臨床實踐中，含有馬錢子的中藥成方，例如痹祺膠囊、九分散及腰痛寧等在骨關節炎的治療中療效明顯[17-18]。研究[11-12]發現，馬錢子堿具有抗腫瘤、抗心律失常、抗骨關節炎的作用，在骨關節炎作用尤為突出。馬錢子堿可明顯抑制軟骨細胞凋亡[19]，促進體外培養的人軟骨細胞增殖[20]。

研究[21-23]發現，Zinc-ZIP8-MTF1信號通路在KOA軟骨退變中發揮了重要作用。當關節軟骨遭受到機械壓力損傷、炎性因子刺激等傷害時，Zn2+轉運蛋白ZIP8表達水平明顯增加，介導細胞外Zn2+大量內流；而隨著細胞內Zn2+水平增加，Zinc-ZIP8-MTF1信號通路下游轉錄因子MTF1被激活，活化的MTF1促進軟骨細胞中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表達，激活分解代謝級聯反應，介導KOA軟骨病變[21-23]。

近年來研究[24-25]發現，Zn2+與骨關節炎關系密切。研究[25-26]發現，在骨關節炎患者的血液和尿液中Zn2+高表達，Zn2+可作為KOA早期診斷指標。此外，研究[27]發現，Zn2+在老年人的關節軟骨潮線區有特異性積累。Zn2+是人體重要的微量元素，它在細胞水平始終處于動態平衡，當這種動態平衡被打破時，人體容易出現胚胎發育異常、免疫功能低下及腫瘤等多種疾病[28-30]。因此，維持Zn2+的穩態對保持細胞正常功能和機體健康具有重要意義。

Zn2+的穩態調節主要受ZNT家族、ZIP家族、MTs及MTF1等蛋白調控[29，31]。ZNT家族主要把Zn2+從細胞內轉運到細胞外，負責Zn2+流出。ZIP家族主要是把Zn2+轉運到細胞內，其中與骨關節炎密切相關的是ZNT9和ZIP8。MTs主要儲存Zn2+，調節Zn2+表達[21]。MTF1的主要特征是激活MTs，并且在調節細胞內Zn2+水平方面具有重要作用[21，28]。本研究探討了馬錢子堿對ZIP8、ZNT9、MTF1、MTS 基因和蛋白的影響。結果發現，空白對照組中Zn2+未見表達，而模型組軟骨細胞內Zn2+表達明顯增加；經馬錢子堿藥物干預后，馬錢子堿高、中劑量組小鼠軟骨細胞內Zn2+表達明顯降低，且馬錢子堿高劑量組Zn2+表達更低。同時，與空白對照組比較，模型組ZIP8、MTF1 mRNA和蛋白相對表達量明顯增加(P<0.05)。與模型組相比較，馬錢子堿高、中劑量組ZIP8、MTF1 mRNA和蛋白表達明顯降低(P<0.05)。

綜上所述，本研究發現馬錢子堿可通過降低KOA小鼠ZIP8、MTF1 mRNA和蛋白表達，調控軟骨細胞內Zn2+表達，達到延緩早期KOA模型小鼠軟骨退變的作用機制。但本研究樣本不足，還需擴大樣本進行進一步驗證，且本研究是以動物實驗為基礎，未來對馬錢子堿防治KOA的作用機制還需更多臨床研究。