米諾環素對白念珠菌的抑制作用分析*

鄒 莉，梅 昭，關 濤，鄧 群Δ

三峽大學人民醫院/宜昌市第一人民醫院：1.檢驗科；2藥學部，湖北宜昌 443300

白念珠菌廣泛分布于環境中，被認為是人類最常見的機會性真菌病原體。它容易引起黏膜表面的侵襲性感染，尤其在免疫缺陷和菌群失調患者中可危及其生命。隨著廣泛長期使用抗真菌藥物，白念珠菌耐藥性迅速增加，增加了現有抗真菌藥物對于臨床藥理治療的難度[1]。近年來，科學研究對四環素類抗菌藥物如米諾環素、四環素、多西環素等進行了重新評價，認為它們具有潛在的抗真菌活性[2-3]。本研究通過評估米諾環素對白念珠菌的體外抗真菌活性，為進一步研究米諾環素治療白念珠菌感染的機制提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2020年1-12月分離自本院的酵母菌臨床標本46株，其中白念珠菌17株、熱帶念珠菌7株、葡萄牙假絲酵母菌4株、近平滑念珠菌4株、光滑念珠菌10株、擬平滑假絲酵母菌4株。所有菌株均經全自動微生物質譜檢測儀鑒定到種，質控菌株白念珠菌(ATCC 90028)購自美國菌種保藏中心。

1.2儀器與試劑 VITEK MS全自動快速微生物質譜檢測儀(法國生物梅里埃公司)，米諾環素敏感性測試紙(美國Merck公司)，米諾環素(美國Sigma公司)，葡萄糖美藍M-H藥敏試驗瓊脂平板(美國Thermo公司)，沙氏葡萄糖瓊脂培養基(上海博賽生物技術有限公司)，磷酸鹽緩沖鹽溶液(pH 7.0±2.0，實驗室配制)，96孔板(美國康寧公司)，超微量分光光度計、微孔板酶標儀(美國Thermo公司)，XTT試劑盒(上海生工公司)，YPD液體培養基、YPD固體培養基、RPMI 1640液體培養基(美國Invitrogen公司)，半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3活性測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3菌株的活化及菌液配制 從4 ℃保存的SDA培養基上挑取白念珠菌質控菌株ATCC 90028及酵母菌臨床菌株單菌落接種于YPD液體培養基中，37 ℃搖床振蕩(200 r/min)過夜培養，使菌株處于對數生長期，12 000 r/min離心后收集菌體，磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌菌體2～3次，用RPMI 1640稀釋至1×106CFU/mL保存備用[4]。

1.4抑菌圈測定 使用紙片擴散法對臨床菌株進行藥物敏感試驗將菌株調整為0.5麥氏點的菌懸液，均勻擴散到葡萄糖美藍M-H藥敏平板，待平板表面干燥后貼上含米諾環素抗菌藥物的藥敏試紙，于28 ℃孵育24 h，測量抑菌環的直徑。目前，細菌藥敏紙片對酵母菌的藥敏試驗方法尚無參考標準，但根據本小組的前期數據及研究[5]，筆者大致判斷14 mm是其敏感的抑菌圈折點，抑菌圈直徑≥14 mm判定為陽性。

1.5培養基形態學觀察 配制含不同濃度米諾環素的YPD固體培養基，培養基中包含米諾環素的濃度分別為0、256、512和1 024 μg/mL，按1×105CFU/mL制備白念珠菌ATCC 90028，均勻涂布到YPD平板上，28 ℃孵育48 h，觀察菌落形態。將未加入米諾環素的培養基作為對照組，加入米諾環素的培養基作為米諾環素干預組，米諾環素干預組進一步分為256 μg/mL組、512 μg/mL組、1 024 μg/mL組。

1.6菌絲的形成評估 將對數期白念珠菌細胞(1×106CFU/mL)在多種營養菌絲轉化培養基(RPMI 1640培養基中添加20%胎牛血清)中培養，在含不同濃度米諾環素的24孔組織培養板中，37 ℃搖床孵育，分別在不同時間點(0、6、12 h)采集真菌細胞，采用Image View Systems數字細胞成像系統進行觀察。并計數100個細胞中菌絲所占的比例。

1.7浮游細胞和白念珠菌生物膜的代謝活性 添加100 μL細菌(1×106CFU/mL)液體到96孔培養板，于37 ℃黏附90 min后，吸樣槍輕輕移除未黏附的浮游細胞，再添加100 μL新鮮RPMI 1640培養液，37 ℃培養24 h，直到成熟的生物膜成立。抽吸生物膜上清液，加入含不同濃度米諾環素的RPMI 1640培養液孵育24 h，顯微鏡下觀察生物膜的生長情況，使用XTT試劑盒測量成熟生物膜細胞的代謝活性，用酶標儀于570 nm處以空白孔調零測各孔吸光度(A)值。同樣，為了檢測米諾環素對浮游細胞的影響，在100 μL細菌液體中加入米諾環素，37 ℃搖床培養24 h，在570 nm處測量A值，觀察米諾環素對浮游細胞的作用。

1.8米諾環素對白念珠菌生物膜細胞Caspase 3活性的影響 指數生長期的白念珠菌懸液調整細胞濃度為1×106CFU/mL，用不同劑量的米諾環素處理，37 ℃孵育24 h，離心收集白念珠菌細胞，使用Caspase 3活性測試盒測定生物膜細胞Caspase 3活性。磷酸緩沖鹽溶液輕柔洗滌3次，棄上清液，加裂解液冰浴裂解；4 ℃離心10～15 min，加入反應液、裂解液及AcDEVD-PNA，振蕩重懸沉淀,37 ℃孵育4 h，發現顏色有明顯變化時，離心取上清液，用酶標儀在405 nm測定其A值，計算米諾環素干預組白念珠菌細胞內Caspase 3活性程度的相對值(即A米諾環素干預組/A對照組)。

2 結 果

2.1米諾環素對6種酵母菌作用的比較 米諾環素對酵母菌作用后產生抑菌圈直徑≥14 mm的菌種有3種，抑菌圈最大的是白念珠菌，且抑菌圈陽性率最高，其次為葡萄牙假絲酵母菌和部分熱帶念珠菌；抑菌圈直徑<14 mm的菌種為部分熱帶念珠菌、擬平滑假絲酵母菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌；其中光滑念珠菌的抑菌圈直徑均<6 mm，表明米諾環素對光滑念珠菌沒有抑制作用。各酵母菌的抑菌圈直徑與14 mm比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 米諾環素對酵母菌作用后產生抑菌圈情況的比較

2.2米諾環素對白念珠菌菌落形態的影響 在YPD固體培養基，對照組白念珠菌菌落表面出現寬型褶皺及白斑，顯示出明顯的絲狀結構；米諾環素干預組白念珠菌菌落表面相對光滑，褶皺及白斑明顯減少，絲狀結構和菌落大小隨米諾環素濃度增加而減少，見圖1。

注：白念珠菌ATCC 90028在不同濃度米諾環素的YPD固體培養基上，28 ℃培養48 h。

2.3米諾環素對白念珠菌菌絲生長的影響 顯微鏡觀察結果表明，米諾環素抑制了白念珠菌由酵母形式向菌絲形式的轉化。6 h后，對照組有大量菌絲生長，而米諾環素干預組菌絲生長均受到明顯抑制，256 μg/mL組此時菌絲所占比例最小，為13.33%±2.05%；在12 h后，對照組菌絲大量萌芽，菌絲數量及長度明顯增加，米諾環素干預組菌絲增長緩慢，其生長明顯受抑制，256 μg/mL組此時菌絲所占比例最小，為15.00%±2.94%，米諾環素在256 μg/mL組展示出最佳抑制效果。見圖2。

注：與同時期對照組比較，aP<0.05。

2.4米諾環素對白念珠菌生物膜和浮游細胞代謝活性的影響 XTT還原試驗結果顯示，加入米諾環素后，白念珠菌生物膜代謝活性明顯下降。256 μg/mL組中，白念珠菌生物膜代謝活性為33%，隨著米諾環素濃度的增加，白念珠菌生物膜代謝活性下降趨于穩定，米諾環素干預組各組與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。但米諾環素對白念珠菌浮游細胞代謝活性沒有明顯抑制作用，在不同米諾環素干預組中，其代謝活性僅略有降低，米諾環素干預組各組與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

2.5米諾環素對白念珠菌生物膜細胞Caspase 3活性的影響 與對照組比較，256 μg/mL組、512 μg/mL組、1 024 μg/mL組Caspase 3活性程度均升高(P<0.05)，但米諾環素干預組各組間的Caspase 3活性程度比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

注：與同對照組比較，aP<0.05。

表2 4組白念珠菌生物膜細胞Caspase 3活性比較

3 討 論

近年來，由于環境和機體的不斷刺激導致真菌變化和突變，以及廣泛和長期使用有限的抗真菌藥物，使白念珠菌耐藥性迅速增加，給白念珠菌感染患者的治療帶來了很大的困難。為了解決現有抗真菌藥物對于患者的臨床藥理治療的缺陷，研究者正在不斷尋找新的抗真菌藥物或現有抗真菌藥物的增敏劑，有研究者發現，米諾環素聯合其他抗菌藥物對金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌和白念珠菌均有加強抑制作用[2,7]。

米諾環素為一種傳統的抗細菌藥物,本研究發現，米諾環素對酵母菌顯示出不同的抑菌效果，但是目前米諾環素對假絲酵母菌屬的藥敏試驗方法尚無操作標準及規范化，筆者通過紙片擴散法結果發現，米諾環素對白念珠菌、葡萄牙假絲酵母菌和部分熱帶念珠菌抑菌圈直徑均≥14 mm，表明米諾環素具有較強的抗酵母菌活性，其中對白念珠菌具有明顯的抑制作用。米諾環素對部分熱帶念珠菌、擬平滑假絲酵母菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌作用后產生抑菌圈直徑均<14 mm，說明其對這幾種酵母菌無抑制作用，這可能與酵母菌的種類、形態轉化和毒力有關[8]，需要進一步的研究來證實。

形態轉變在真菌生物膜的生物學及其與宿主的相互作用中起著重要作用。ZHONG等[9]研究證實，絲狀真菌在生長形成生物膜過程中，其長度和厚度直接影響菌絲的致病性，且二者呈正相關。白念珠菌的菌絲由于形態豐富多樣，其菌絲形式比酵母形式更難被宿主的防御系統所消除，故菌絲形式下致病性比酵母形式強[10]。本研究結果顯示，在YPD固體培養基，對照組白念珠菌菌落表面出現寬型褶皺，顯示出明顯的絲狀結構；加入米諾環素后白念珠菌菌落表面褶皺減少，相對光滑，且絲狀結構隨米諾環素濃度增加而減少或是消失。本研究選取了3個時間點進行研究，分別為0、6、12 h。在不同時間點，白念珠菌的菌絲形式和酵母形式所占比例不同。一般情況下，隨著白念珠菌生長，菌絲會隨之生長，菌絲所占比例增大。本研究結果顯示，在6 h后，對照組有大量菌絲生長，而在米諾環素干預組中，菌絲生長均受到明顯抑制，12 h后對照組菌絲大量萌芽，菌絲數量及長度明顯增加，而米諾環素干預組中，白念珠菌菌絲生長仍明顯受到抑制，在米諾環素干預組各組之間，256 μg/mL組菌絲所占比例最小。提示米諾環素對白念珠菌菌絲生長具有抑制作用，明顯抑制了白念珠菌從酵母形式向菌絲形式的轉化，且256 μg/mL濃度的米諾環素對白念珠菌具有最佳抑制作用。SANAE[11]認為這可能與芽孢相關基因HWP1、ECE1及ALS3下調密切相關，米諾環素作用于白念珠菌菌絲生長這一過程，與傳統的抗真菌藥物氟康唑、兩性霉素B作用于白念珠菌的過程大致相同[12-13]。

白念珠菌生物膜是一個復雜的三維結構，可以增強其對常見的抗真菌藥物的耐藥性，也給白念珠菌感染的臨床治療增加了難度[14]。本研究XTT還原試驗結果表明，米諾環素能明顯抑制白念珠菌生物膜代謝活性，256 μg/mL組生物膜代謝活性下降最明顯，此濃度下代謝活性僅為33%，隨著米諾環素濃度的增加，其對生物膜代謝活性的抑制作用趨于穩定。說明米諾環素濃度為256 μg/mL時對生物膜代謝活性的抑制作用已達到或接近最佳效果，這可能與生物膜代謝及此濃度下菌絲所占比例最小有關。值得注意的是，對照組和米諾環素干預組浮游細胞的代謝活性差異無統計學意義(P>0.05)，即米諾環素對白念珠菌浮游細胞的代謝活性無明顯抑制作用。

Caspase家族可以改變自身分子構象而自我激活，激發Caspase 3發生級聯反應，選擇性地切割多種細胞質、細胞核蛋白質，促進廣泛的蛋白質分解改變，最終啟初受損組織的細胞凋亡[15]。Caspase 3是Caspase一系列級聯反應的關鍵酶，是誘導細胞凋亡、死亡的最終執行者[16-19]。本研究結果顯示，加入米諾環素可明顯提高生物膜細胞內Caspase 3活性，推測米諾環素對白念珠菌的凋亡作用是通過Caspase 3的作用導致其生物膜的凋亡。

近年來，有研究者發現，米諾環素在與抗真菌藥物如氟康唑合用時，可增強氟康唑穿透生物膜的能力，誘導細胞內鈣釋放，可在減小氟康唑使用劑量的同時達到相同的抑菌效果，二者對白念珠菌的體外生長產生協同抑制作用，其作用機制可能與環磷酸腺苷的水平及相關的轉錄因子有關[2]。此外，米諾環素與氟康唑聯合應用對新型隱球菌同樣表現出持續抑制細胞膜和抗真菌活性的作用[20]，且在動物模型中也發現，米諾環素與氟康唑聯用能保護幼蟲免受耐藥性新型隱球菌的感染[3]。本研究發現，米諾環素對白念珠菌體外活性的抑制作用主要表現在抑制其菌絲生長、激活Caspase 3活性，從而導致生物膜代謝活性下降和細胞凋亡，目前國內外鮮見報道。鑒于此，筆者推測米諾環素作用于真菌生物膜發揮其抗真菌活性的過程可能涉及多個通路及轉錄因子，其相關機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究證實了米諾環素對白念珠菌具有較強的抗生物膜活性及凋亡作用，提示米諾環素可能是一種有效的抗白念珠菌感染的藥物。這為米諾環素臨床治療白念珠菌感染提供了重要的試驗依據，具有潛在的應用價值。但需要更多的敏感株、耐藥株及動物模型來進一步深入驗證米諾環素的臨床適用性，對其深入研究對進一步闡明白念珠菌耐藥的發生機制及尋找新型抗真菌藥物均有重要意義。