CBX4和NET-1在原發性直腸癌中的表達變化及臨床意義*

王 凡，王明輝，王建勛，張四新

1.唐山市協和醫院普外科，河北唐山 063000;2.唐山市中醫醫院普外科，河北唐山 063000;3.安國市醫院普外科，河北安國 071200;4.解放軍陸軍第82集團軍醫院普外科，河北保定 071000

直腸癌是臨床常見的消化系統惡性腫瘤，發病率和病死率均居中國惡性腫瘤第5位。據相關研究統計，中國每年新增結直腸癌病例數約37萬，其中死亡例數高達19.1萬，該病嚴重危害人們的身體健康[1-2]。因早期直腸癌臨床癥狀不明顯，容易導致多數患者未能及時診治，確診時往往已發展至中晚期，且易復發，預后差，治療過程非常痛苦[3]。流行病學調查顯示，中國結直腸癌患者5年生存率僅為32%，遠低于美國水平(64%)[4]，因而深入探究與結直腸癌發生、發展相關的分子標志物，對疾病的早期確診、及時治療和預后改善具有重要價值。染色盒同源物4(CBX4)屬于PcG蛋白家族的成員，最初被證實具有E3連接酶活性，參與染色質重組與轉錄抑制，近來有研究發現，其還與癌癥的侵襲與遷移相關[5]，但當前少有研究探討CBX4與腫瘤的關系。新四極體-1(NET-1)是新發現的一種腫瘤基因，與腫瘤細胞的分裂增殖、浸潤遷移有關[6]，而其在直腸癌中的研究很少見。因此，本研究通過測定直腸癌組織中CBX4和NET-1表達水平，分析其與患者臨床病理參數及預后的關系，并對二者致癌作用的相關性進行分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取唐山市協和醫院在2013年4月至2015年7月收治的行手術切除的原發性直腸癌患者50例，手術過程中留取所有患者癌組織和癌旁正常直腸組織，其中男28例，女22例；年齡37～75歲，平均(55.22±8.14)歲；37～60歲有32例，>60～75歲有18例；吸煙27例，不吸煙23例；飲酒25例，不飲酒25例；TNM分期[7]：Ⅰ+Ⅱ期16例，Ⅲ+Ⅳ期34例；淋巴結轉移28例，無淋巴結轉移22例；分化程度：高、中分化35例，低、無分化15例；腫瘤最大徑：≥5 cm 29例，<5 cm 21例；漿膜浸潤36例，非漿膜浸潤14例。本研究經唐山市協和醫院倫理委員會批準。所有患者及其家屬均支持本研究，并簽署知情同意書。

1.2納入與排除標準 納入標準：(1)經臨床病理學診斷并確診為原發性直腸癌；(2)臨床病理資料完整、詳細；(3)行該手術前未接受任何針對性治療。排除標準：(1)合并有其他惡性腫瘤；(2)合并有其他對患者生存期有影響的疾病；(3)病理資料缺失；(4)精神障礙，無法完成術后隨訪。

1.3儀器與試劑 兔抗人CBX4抗體(生產批號：FNab01331)、兔抗人NET-1抗體(生產批號：FNab05665)、兔抗人二抗(生產批號：FNab00119)均購自武漢菲恩生物科技有限公司；免疫組織化學染色試劑盒(生產批號：YDJ4123)購自上海羽朵生物科技有限公司。生物顯微鏡(型號：BS200)購自北京佳源興業科技有限公司；輪轉式切片機(型號：SPCC-315)購自東莞市譜標實驗器材科技有限公司。

1.4直腸癌組織及癌旁正常直腸組織中CBX4和NET-1水平檢測 采用免疫組織化學法測定CBX4和NET-1在原發性直腸癌組織及癌旁正常組織中表達水平，由同一病理科醫生獨立完成所有病理標本的檢測。常規制作相應石蠟標本，約4.0 μm薄片，60 ℃烘干后依次用二甲苯及梯度乙醇脫蠟，3%過氧化氫滅活后修復組織抗原，滴加CBX4或NET-1單克隆抗體孵育過夜，滴加二抗，37 ℃孵育10 min，滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物，滴加配制的DAB顯色劑進行顯色后，用蘇木素復染，梯度乙醇常規洗脫脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。用試劑盒提供的陽性病理切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。實驗結果均由1名實驗人員和2名專業醫師根據評分標準[8]獨立判斷評定，若結果不同，經討論后共同決定。著色深度評定：CBX4和NET-1陽性表達為細胞質及細胞膜中出現棕黃色或棕褐色顆粒。陽性表達強度依據陽性著色深度進行評分：樣品無染色記為0分，淺黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。隨機選取8個高倍視野(×400)，按照著色細胞相對水平(即所占百分比)評分：<5%記為0分，5%～25%記為1分，>25%～50%記為2分，>50%～75%記為3分，>75%記為4分。根據二者乘積(著色深度評分×著色細胞相對含量)大小評定結果：0～3分為陰性(-)，>3～12分為陽性(+)。其中陰性代表低表達，陽性代表高表達。

1.5病例隨訪 對所有原發性直腸癌患者進行常規隨訪，隨訪時間為0～60個月，平均(38.96±9.75)個月。隨訪以電話、復查的形式進行，1次/月。隨訪截止時間為2020年7月31日，死亡患者以死亡日期作為隨訪截止時間，觀察并統計隨訪時間內患者生存情況。本次研究隨訪率為100%，所有患者無一缺訪。

2 結 果

2.1CBX4和NET-1在原發性直腸癌患者癌組織及癌旁正常直腸組織中CBX4和NET-1陽性表達水平比較 原發性直腸癌患者癌組織中CBX4陽性表達率為74.00%，明顯高于癌旁組織的28.00%，差異有統計學意義(P<0.05)；NET-1陽性表達率為68.00%，明顯高于癌旁正常組織的24.00%，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

注：A為直腸癌組織CBX4陽性；B為直腸癌組織CBX4陰性；C為直腸癌組織NET-1陽性；D為直腸癌組織NET-1陰性；E為癌旁正常直腸組織CBX4陽性；F為癌旁正常直腸組織CBX4陰性；G為癌旁正常直腸組織NET-1陽性；H為癌旁正常直腸組織NET-1陰性。

表1 原發性直腸癌患者癌組織及癌旁正常直腸組織中CBX4和NET-1陽性率比較[n(%)]

2.2CBX4和NET-1表達水平與直腸癌患者臨床病理特征的關系 原發性直腸癌組織中的CBX4和NET-1表達水平在不同性別、年齡、吸煙、飲酒及腫瘤最大徑的患者之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而在不同TNM分期、不同淋巴結轉移情況、不同分化程度、有無漿膜浸潤患者之間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 CBX4和NET-1表達水平與直腸癌患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3直腸癌組織中CBX4和NET-1表達的相關性分析 Spearman相關性分析結果顯示，直腸癌組織中CBX4表達水平與NET-1表達水平呈正相關(r=0.647，P<0.05)。

2.4CBX4和NET-1表達情況與原發性直腸癌患者生存率的關系 對50例患者進行為期5年隨訪，存活16例，死亡34例，總生存率32.00%(16/50)。其中CBX4高表達患者5年生存率[21.62%(8/37)]明顯低于CBX4低表達患者5年生存率[61.54%(8/13)]，差異有統計學意義(χ2=7.044，P=0.008)；NET-1高表達患者5年生存率[17.65%(6/34)]明顯低于NET-1低表達患者5年生存率[62.50%(10/16)]，差異有統計學意義(χ2=10.059，P=0.002)。見圖2。

2.5影響原發性直腸癌患者預后危險因素的Logistic回歸分析 以原發性直腸癌患者手術后隨訪5年的生存結局為因變量(1=存活，0=死亡)，TNM分期、淋巴結轉移、分化程度、漿膜浸潤及CBX4、NET-1表達水平為自變量，Logistic分析結果顯示，TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期)、淋巴結轉移及CBX4、NET-1高表達都是影響原發性直腸癌患者預后的因素(P<0.05)。見表3。

注：A為CBX4表達情況與原發性直腸癌患者生存率的關系；B為NET-1表達情況與原發性直腸癌患者生存率的關系。

表3 影響原發性直腸癌患者預后危險因素的Logistic回歸分析結果

3 討 論

直腸癌是一種原發于直腸黏膜的惡性腫瘤，屬于常見的潛在致死性疾病，該疾病高發人群為40歲以上男性，發病早期癥狀不明顯，隨著病情發展，臨床主要表現為腹痛、腹部腫塊、腸梗阻、低熱、乏力等，極大降低了患者的生活質量。臨床治療直腸癌常以手術為主，但因其位置深入盆腔、解剖關系較復雜，致使手術難度增大，術后預后差且易復發，生存率低[9-10]。因此，臨床上尋找能有效預測直腸癌患者預后的指標尤為重要，以便對患者提前干預，進而改善預后，降低癌癥復發，延長生存期，提高生存率。

PcG蛋白是一類在調節細胞周期、DNA修復及細胞分化、衰老、死亡中具有重要作用的蛋白，在哺乳動物中主要由PcG蛋白復合體1(PRC1)和PRC2組成[11-13]。CBX4屬于PRC1核心成員之一，可通過增強低氧誘導血管內皮生長因子的表達和促進血管的生成，增加原發性肝細胞癌的侵襲和轉移[14]。陳鵬等[15]在研究microRNA-195通過抑制CBX4在肝癌中的作用時發現，CBX4在肝癌中的過度表達可恢復癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進腫瘤的生長。上述結果均提示，CBX4在原發性肝細胞癌中表達水平升高。宋秀道等[16]研究發現，CBX4與肝癌患者組織學分級、腫瘤轉移分期、微血管密度、遠處轉移及血行轉移有關，且是影響肝癌患者預后的獨立因素，提示CBX4有可能成為判斷腫瘤患者預后的分子標志物。NET-1與腫瘤的表達有關，屬于四聚體超家族的成員之一，其廣泛參與多種惡性腫瘤的發生、發展。有研究表明，NET-1在多種惡性腫瘤中(如胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等)表達水平明顯升高[17-19]。楊永江等[20]探討了NET-1在結腸癌中的表達水平、臨床意義和預后分析，結果顯示，NET-1蛋白在結腸癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，且其與腫瘤的TNM 分期、脈管浸潤、淋巴結轉移及肝轉移等病理參數密切相關；NET-1陽性組的中位生存時間明顯短于陰性組，并且其表達水平與結腸癌患者的預后相關，以上結果提示NET-1的異常表達在結腸癌病變的發生、發展中具有重要作用，并與患者的生存期有關，是結腸癌潛在的生物學指標。

本研究中原發性直腸癌組織中CBX4和NET-1陽性表達率均明顯高于癌旁組織(74.00%、68.00%vs.28.00%、24.00%)，說明在直腸癌組織中CBX4和NET-1表達上調，同郭飛等[4]結果顯示NET-1在直腸癌中呈高表達相一致，提示二者與原發性直腸癌有關。研究進一步分析發現，原發性直腸癌組織中的CBX4和NET-1表達水平在不同性別、年齡、不同吸煙、飲酒情況及不同腫瘤最大徑的患者之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而在不同TNM分期、不同淋巴結轉移情況、不同分化程度、不同漿膜浸潤情況患者之間，差異有統計學意義(P<0.05)。提示CBX4和NET-1二者可能通過某種作用機制參與原發性直腸癌的發生、發展進程，但針對其具體機制仍有待后期深入探究，進而為臨床診治予以科學依據支持。相關性分析顯示，CBX4和NET-1表達水平在直腸癌組織中呈正相關，也推測二者可能在疾病中具有協同作用，影響淋巴結轉移或腫瘤細胞增殖、遷移等，因此也提示臨床可將二者聯合檢測，提高診治準確性；另外，術后隨訪發現，CBX4和NET-1高表達直腸癌患者5年生存率均明顯低于CBX4和NET-1低表達患者，提示二者呈高表達患者預后差，2項指標可能成為評價患者預后的有效指標。Logistic分析顯示，TNM分期、淋巴結轉移及CBX4、NET-1高表達都是影響直腸癌患者預后的因素，提示CBX4和NET-1高表達患者應進行定期檢查，及時發現、治療，降低預后不良的風險。本研究也受隨訪時間、樣本量少等因素限制，選取病例時間較早，結果存在一定不足，仍需大樣本、前瞻性研究進一步驗證結果。

綜上所述，CBX4和NET-1在直腸癌組織中陽性表達率明顯升高，與患者TNM分期、淋巴結轉移、分化程度、漿膜浸潤有關，且二者呈正相關，與生存率相關，影響患者預后，可能作為評價直腸癌患者預后的臨床指標。