Piwil2、Bcl-2在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中的表達及相關性*

李 偉，李宏偉，黃 勇，牛曉東，李鳳玉

中國人民解放軍陸軍第81集團軍醫院:1.病理科;2.腫瘤科，河北張家口 075000

乳腺惡性葉狀腫瘤作為一種發病率極低的乳腺腫瘤疾病，分屬于乳腺分葉狀腫瘤，多發于中年女性患者，具有較高的生存率，但復發率較高[1-2]。乳腺惡性葉狀腫瘤臨床癥狀為單側無痛硬質包塊，多數患者發病快，發病數周內即可確診，少數患者腫瘤生長期漫長，可達多年[3]。干細胞蛋白Piwil樣蛋白2(Piwil2)屬于Piwi亞家族成員之一，在干細胞發育、自我更新、RNA轉錄調控機制及誘導沉默中具有重要意義[4]。Piwil2可通過抑制細胞凋亡促進癌癥的發生[5]，已有研究表明，Piwil2在乳腺癌組織中異常高表達[6]。B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)是一種抗凋亡蛋白，在線粒體外膜通過控制線粒體膜的通透性調節細胞生理活動，除此之外，其在腫瘤的侵襲和轉移中起重要的作用[7]。已有研究表明，Bcl-2在結直腸癌組織中呈異常高表達狀態[8]。目前，關于Piwil2和Bcl-2與乳腺惡性葉狀腫瘤相關性的研究相對較少，因此本研究通過檢測Piwil2、Bcl-2在乳腺惡性葉狀腫瘤患者腫瘤組織中的表達情況，對二者與乳腺惡性葉狀腫瘤疾病的相關性進行分析，以期為疾病的檢測及術后復發情況提供研究依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年9月至2015年10月中國人民解放軍第81集團軍醫院確診的30例乳腺惡性葉狀腫瘤患者作為乳腺惡性葉狀腫瘤組，平均年齡(41.31±13.54)歲；月經15例，無月經15例；年齡≥45歲有17例，年齡<45歲有13例；腫瘤最大徑<5 cm有10例，腫瘤最大徑≥5 cm有20例；有淋巴結轉移18例，無淋巴結轉移12例；腫瘤部位：左乳16例，右乳14例。30例患者腫瘤均原發于乳腺，為無痛性包塊且病程多為2周至3年。另選取同期32例乳腺纖維腺瘤患者作為對照組，平均年齡(42.65±12.11)歲；月經15例，無月經17例；年齡≥45歲有16例，<45歲有16例；腫瘤最大徑<5 cm有12例，腫瘤最大徑≥5 cm有20例；腫瘤部位：左乳17例，右乳15例。本研究通過醫院倫理委員會批準，所有患者和家屬均知情并簽署同意書。

乳腺惡性葉狀腫瘤診斷標準參照《WHO乳腺腫瘤分類》[9]中的相關內容：核分裂象≥10HPF，組織細胞異質性明顯，浸潤性邊界，出現惡性異源性成分，間質過度增生。納入標準：(1)經活檢等手段檢查確診，臨床資料完整；(2)進行手術切除治療，術前未進行其他輔助性治療。排除標準：(1)在近期進行過化療或手術等治療；(2)患其他惡性腫瘤及免疫系統疾病；(3)未經明確病理診斷確診；(4)臨床資料不完整。

1.2儀器及試劑 兔抗人Piwil2多克隆抗體(批號：PAB27177)購自武漢艾美捷科技有限公司；Bcl-2多克隆抗體(批號：PAB8567)購自上海群己生物科技有限公司；即用型SP免疫組化試劑盒(批號：CDJ-1593C-SJH)購自武漢純度生物科技有限公司；顯微鏡(型號：CI-POL)購自日本尼康公司。

1.3研究方法

1.3.1標本采集 對照組術中取乳腺纖維腺瘤組織，乳腺惡性葉狀腫瘤組患者取手術切除腫瘤組織作為標本。生理鹽水清理各組織標本，甲醛固定后進行石蠟包埋、切片(5 μm)。

1.3.2免疫組化法檢測Piwil2、Bcl-2表達 將上述石蠟切片使用二甲苯進行脫蠟、水化后采用磷酸鹽緩沖鹽溶液沖洗5 min。根據試劑盒說明書采用SP法染色，再用蘇木精復染、重新水化后封片進行觀察。

結果判定如下[10]，根據染色強度：未染色記為0分，弱陽性染色記為1分，中等陽性染色記為2分，強陽性染色記為3分；根據陽性細胞占比：陽性細胞占比≤25%為0分，25%<陽性細胞占比≤50%為1分，50%<陽性細胞占比≤75%為2分，陽性細胞占比>75%為3分。兩項評分乘積即染色指數(SI)：陰性(-)，SI≤1；弱陽性(+)，1

1.4隨訪 對出院患者進行為期5年的隨訪，截止時間為患者復發時間或至2020年10月，以電話或復查形式記錄患者術后復發情況。

1.5統計學處理 使用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計數資料以頻數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman分析Piwil2和Bcl-2表達的相關性；采用COX回歸分析影響乳腺惡性葉狀腫瘤術后復發的因素。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1Piwil2、Bcl-2在對照組和乳腺惡性葉狀腫瘤組組織中的表達情況 Piwil2、Bcl-2在乳腺惡性葉狀腫瘤組中的陽性率均明顯高于對照組(P<0.05)。見表1、2。

表1 Piwil2在對照組和乳腺惡性葉狀腫瘤組組織中的表達情況[n或n(%)]

表2 Bcl-2在對照組和乳腺惡性葉狀腫瘤組組織中的表達情況[n或(%)]

2.2乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2表達的相關性 在30例乳腺惡性葉狀腫瘤患者中，有17例患者Piwil2、Bcl-2均為陽性表達，有8例患者均為陰性表達；有3例患者Piwil2呈陽性表達而Bcl-2呈陰性表達，有2例患者Bcl-2呈陽性表達而Piwil2呈陰性表達。結果顯示，乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2的表達有一定關系(P<0.05)。見表3。

表3 乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2表達的相關性(n)

2.3Piwil2、Bcl-2表達情況與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理參數的關系 乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2的表達在不同月經情況、不同年齡、腫瘤最大徑、腫瘤部位患者之間差異無統計學意義(P>0.05)；有淋巴結轉移的乳腺惡性葉狀腫瘤患者組織中Piwil2、Bcl-2陽性率分別高于無淋巴結轉移的乳腺惡性葉狀腫瘤患者組織(P<0.05)。見表4。

表4 Piwil2、Bcl-2表達情況與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理參數的關系[n(%)]

2.4乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2表達與患者術后復發的關系 經過5年隨訪后，30例乳腺惡性葉狀腫瘤患者中有8例復發，復發率為26.67%。Piwil2陰性患者和陽性患者復發率分別為0.00%(0/10)、40.00%(8/20)，差異有統計學意義(χ2=4.138，P=0.042)；Bcl-2陰性患者和陽性患者復發率分別為0.00%(0/11)、42.11%(8/19)，差異有統計學意義(χ2=4.346，P=0.037)。

2.5COX回歸分析影響乳腺惡性葉狀腫瘤術后復發的因素 單因素分析發現，淋巴結轉移、Piwil2和Bcl-2陽性表達均對乳腺惡性葉狀腫瘤的術后復發存在影響(P<0.05)。多因素分析發現，淋巴結轉移、Piwil2陽性表達和Bcl-2陽性表達均是影響患者術后復發的獨立危險因素(P<0.05)。見表5。

續表4 Piwil2、Bcl-2與乳腺惡性葉狀腫瘤臨床病理參數的關系[n(%)]

表5 COX回歸分析影響乳腺惡性葉狀腫瘤術后復發的因素

3 討 論

乳腺惡性葉狀腫瘤是一種極為少見的惡性腫瘤，其起源于小葉內或導管周圍間質，僅占原發性乳腺腫瘤的0.9%，而復發率約為30%[11-12]。乳腺惡性葉狀腫瘤的發生機制至今尚未研究清楚，其病理特征常表現為組織細胞異質性明顯、浸潤性邊界、出現惡性異源性成分、間質過度增生，常出現肺部轉移情況[13-14]。雖然乳腺惡性葉狀腫瘤發病率較低，但其造成的死亡多發生在確診后5年內，而且其復發仍是臨床一大難題，因此嚴重威脅人們的生命健康和生活質量。本研究通過檢測Piwil2、Bcl-2在乳腺惡性葉狀腫瘤患者腫瘤組織中的表達情況，對二者與乳腺惡性葉狀腫瘤疾病的相關性進行分析，以期為疾病檢測、臨床特征分析及預后復發等情況提供信息依據。

Piwi家族在多種生物中表現高度保守，并且在多種人類癌癥中異常表達，與腫瘤的發生和預后相關，Piwil2則屬于Piwi亞家族成員之一[15-16]。有研究表明，piR-932/Piwil2免疫共沉淀復合物的增加通過降低血小板生成素的表達，促進乳腺癌細胞上皮-間質轉化[17]。Piwil2過表達激活內源性RNA，增強信號轉導和轉錄活化因子3(STAT3)/B淋巴細胞瘤-xL(Bcl-xL)、STAT3/CynlinD1信號通路，從而參與腫瘤的發生。研究發現，Piwil2在乳腺癌組織中陽性率明顯高于癌旁組織，說明Piwil2可能調控乳腺癌的發生發展機制[6]。本研究結果表明，Piwil2在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中的陽性率明顯高于乳腺纖維腺瘤組織，與上述結果相一致，這表明Piwil2可能通過調節腫瘤相關信號通路參與乳腺惡性葉狀腫瘤的發生過程。

有報道稱，Bcl-2可通過延長腫瘤細胞生存期達到抑制其凋亡的作用，從而參與腫瘤的發生、發展[18-19]。還有研究表明，Bcl-2通過增強上皮間質中堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子1(Twist1)在轉化中的作用從而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移[20]。Bcl-2已被報道在多種癌組織中異常高表達[21]，肖曉嵐等[22]研究發現，Bcl-2在乳腺葉狀腫瘤組織中表達明顯增加，并隨腫瘤的惡性程度增加而明顯增加。本研究結果發現，Bcl-2在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中的陽性率明顯高于乳腺纖維腺瘤組織，這表明Bcl-2可能通過抑制細胞凋亡參與乳腺惡性葉狀腫瘤的發生過程。還有研究報道稱，Piwil2通過上調STAT3和Bcl-2基因表達，促進細胞周期從G0/G1到S期的轉變及核因子-κB(NF-κB)的表達來促進腫瘤的增殖[5]。本研究結果也發現，乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2的表達存在一定關系，表明Piwil2、Bcl-2可能通過相互作用共同促進乳腺惡性葉狀腫瘤的發生。

除此之外，本研究還發現有淋巴結轉移的乳腺惡性葉狀腫瘤組織中Piwil2、Bcl-2陽性率分別高于無淋巴結轉移的乳腺惡性葉狀腫瘤組織，且二者陽性表達會導致患者術后復發率升高。多因素分析發現，淋巴結轉移、Piwil2陽性表達和Bcl-2陽性表達均是影響乳腺惡性葉狀腫瘤術后復發的獨立危險因素。提示，Piwil2、Bcl-2可作為乳腺惡性葉狀腫瘤臨床監測和預后復發情況的檢測指標。

綜上所述，Piwil2、Bcl-2在乳腺惡性葉狀腫瘤組織中的陽性率明顯增加，并且淋巴結轉移、Piwil2陽性表達和Bcl-2陽性表達均是影響患者術后復發的獨立危險因素。本研究為乳腺惡性葉狀腫瘤發生機制的研究提供了依據，Piwil2、Bcl-2有作為乳腺惡性葉狀腫瘤臨床預后檢測指標的潛能。